多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位.PDFVIP

第３４卷第１１期 第　三　军　医　大　学　学　报 Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１１ １０４４ ２０１２年６月１５日　　　　　　　　　　 Ｊ　Ｔｈｉｒｄ　Ｍｉｌ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ 　　　　　　　　　　 Ｊｕｎ．１５　２０１２ 论著 文章编号：１０００５４０４（２０１２）１１１０４４０４ 多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位 １，２ １，３ １ ２ 靳志平 ，谭晓华 　　（１００７００北京，北京军区总医院中心实验科 ；４０００３８重庆，第三军医大学研究生管理大队学员２队 ； ３ ３００１４２天津，天津迪艾细胞与分子医学发展有限公司 ） 　　［摘要］　目的　构建一种多基因表达载体，实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细 胞不同细胞器中的定位。方法 　利用存在于某些病毒核酸序列中的不同２Ａ肽，合成 １段包括２个２Ａ肽和不同限制性 内切酶位点的多肽序列，形成单一的开放读码框，插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｍｙｃ／Ｈｉｓ（Ｂ）相应的多克隆位点中， 然后将带有膜定位的红色荧光蛋白（ＥＲＦＰ）、核定位的绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）和胞浆定位的黄色荧光蛋白（ＥＹＦＰ）顺序插 入２Ａ肽之间的位点中，构建多基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１ＲＧＹ。用脂质体转染小鼠成纤维ＮＩＨ３Ｔ３细胞和人肾胚２９３ 细胞，利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达和亚细胞定位。结果　 转染２４ｈ后用流式 细胞仪检测，可同时检测到ＥＧＦＰ和ＥＲＦＰ的表达，且两种荧光蛋白的表达率十分接近；荧光显微镜下同时观察到绿色和 红色荧光；共聚焦显微镜观察到在单一细胞上同时显示３种荧光，ＥＲＦＰ定位在细胞膜上，ＥＧＦＰ在细胞核中，而ＥＹＦＰ在 细胞质中。结论　 通过串联方式将多个２Ａ肽和基因置于同一个开放读码框中可实现在同一启动子的调控下表达多个 基因。此外，在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器，实现同一细胞中不同的亚 细胞定位。 　　［关键词］　 真核表达载体；基因表达；信号肽序列；亚细胞定位；２Ａ肽 　　［中图法分类号］　Ｑ５０３；Ｑ７８２　　 ［文献标志码］　Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｇｅｎｅｅｕｋａｒｙｏｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｔｉｏｎｏｆ ｉｔｓｐｒｏｄｕｃｔｓ １，２ １，３ １ ２ ＪｉｎＺｈｉｐｉｎｇ ，ＴａｎＸｉａｏｈｕａ （ＣｅｎｔｒａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＢｅｉｊｉｎｇＭｉｌｉｔａｒｙＣｏｍｍａｎｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１００７００； ２ｎｄ ３ ＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅＴｅａｍ，ＴｈｉｒｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，４０００３８；Ｄｉ’ａｉＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ， Ｔｉａｎｊｉｎ，３００１４２，Ｃｈｉｎａ） 　　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　 Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｍｕｌｔｉｇｅｎｅｅｕｋａｒｙｏｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｉｎｗｈｉｃｈｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｇｅｎｅｓｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｌｏｃａｔｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｅｌｌｅｓｉｎａｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅｓａｍｅｐｒｏ