如何用CRISPR技术敲低(敲除)内源环状RNA(circRNA)2074.pdfVIP

如何用CRISPR 技术敲低（敲除）人源circRNA 汉恒生物提供circRNA 相关病毒包装服务 本文包含以下主要内容： 一、 背景（介绍circRNA 产生的一般原则和Alu 元件） 二、 如何操作（如何精确找到circRNA 两侧毗邻的Alu 元件-两个实例） 三、 题外话（circRNA 过表达成环载体介绍及效率比较） 一、 背景 一个基因在转录的时候往往会产生多个环状RNA (circRNA) ，我们以POLR2A 为例说 明( 图1)。 图1 circbase 数据库里POLR2A 基因位产生的circRNAs 示意图。 不同的颜色 highlight 的是不同研究组报道的circRNAs ，其中最上面 3 个研究组都发现了一个共同的 circRNA-circPOLR2A，下图5 讨论的也正是这条circRNA 。 1 通常情况下circRNA 的产生遵循以下原则（图1 和2 ）： 图2 环状RNA 的基因组特征.  中间的外显子最容易成环，通常包含 2~3 个外显子；如果是一个外显子成环，则其 长度会明显长于平均长度;  成环外显子的两侧内含子较大（~5 倍于随机内含子）;  通常，circRNA 两侧毗邻内含子含有互补的序列，如短间隔重复序列（SINE ）家族 （图4 ）的Alu 元件(the inverted repeated Alu elements, IRAlus)等，且距离成环外 显子边界距离相当（图 2 和 3 ）。 图3 POLR2A 基因位产生的其中一个circRNA-circPOLR2A 及其毗邻的IRAlus 示意图。 Zhang, et al. (2014). Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell 159(1): 134-147. Alu 元件是灵长类基因组中一组散在分布的相关序列，每个长约 300bp。单个Alu 元件成员的每 个末端上有 Alu 限制酶的切割位点，并由此命名。在灵长类的基因组中存在着大量不同种类的 2 Alu 元件。事实上，Alu 元件是人类基因组中丰度最高的转座元件。特别地，Alu 元件在人的基因 组中占比11%，在影响基因表达等方面影响广泛。Alu 元件基本组成模式如下： Part A--AAAAATACAAAAAA --Part B-polyA ，其中A 和B 序列往往类似。 但通常成环外显子两侧毗邻的内含子较大，其中包含的重复序列，如Alu 元件等也往往 是多个并存（图4 ）。简单的原则是：距离最近的IRAlus 优先考虑。但实际的情形具体如何、 能否高效去除内源circRNA 的形成等问题还需要具体问题具体分析。 图4 circHIPK3 的基因组特征—两侧毗邻内含子中的重复序列（SINE ）。 里面包含几十个SINE 元件，但具体哪个（哪些）介导了成环，需要谨慎的下结论（来源于circbase ）。 二、 如何操作 在本文中我们以map circRNA 的IRAlus 为例，示例如何找到元件的边界，从而利 于下游的 CRISPR 操作（CRISPR 操作可以参考实验小白公众号系列文章 3 -shiyanxiaobai ）： 已知：circRNA 的ID、序列 目的：Mapping 到两侧毗邻内含子中IRAlu （反向配对）序列 工具：Snapgene、RepeatMasker 、NCBI blast  circPOLR2A 的例子 1) circBase 调取hsa_circ_0000741 序列 可通过circBase 调取，方法请参考“circRNA 引物设计教程”。 2) 下载人POLR2A 基因的genebank 格式文件（.gb