如何用CRISPR技术敲低(敲除)内源环状RNA(circRNA)2074.pdfVIP

如何用CRISPR技术敲低(敲除)内源环状RNA(circRNA)2074.pdf

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如何用CRISPR技术敲低(敲除)内源环状RNA(circRNA)2074.pdf

如何用CRISPR 技术敲低(敲除)人源circRNA 汉恒生物提供circRNA 相关病毒包装服务 本文包含以下主要内容: 一、 背景(介绍circRNA 产生的一般原则和Alu 元件) 二、 如何操作(如何精确找到circRNA 两侧毗邻的Alu 元件-两个实例) 三、 题外话(circRNA 过表达成环载体介绍及效率比较) 一、 背景 一个基因在转录的时候往往会产生多个环状RNA (circRNA) ,我们以POLR2A 为例说 明( 图1)。 图1 circbase 数据库里POLR2A 基因位产生的circRNAs 示意图。 不同的颜色 highlight 的是不同研究组报道的circRNAs ,其中最上面 3 个研究组都发现了一个共同的 circRNA-circPOLR2A,下图5 讨论的也正是这条circRNA 。 1 通常情况下circRNA 的产生遵循以下原则(图1 和2 ): 图2 环状RNA 的基因组特征.  中间的外显子最容易成环,通常包含 2~3 个外显子;如果是一个外显子成环,则其 长度会明显长于平均长度;  成环外显子的两侧内含子较大(~5 倍于随机内含子);  通常,circRNA 两侧毗邻内含子含有互补的序列,如短间隔重复序列(SINE )家族 (图4 )的Alu 元件(the inverted repeated Alu elements, IRAlus)等,且距离成环外 显子边界距离相当(图 2 和 3 )。 图3 POLR2A 基因位产生的其中一个circRNA-circPOLR2A 及其毗邻的IRAlus 示意图。 Zhang, et al. (2014). Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell 159(1): 134-147. Alu 元件是灵长类基因组中一组散在分布的相关序列,每个长约 300bp。单个Alu 元件成员的每 个末端上有 Alu 限制酶的切割位点,并由此命名。在灵长类的基因组中存在着大量不同种类的 2 Alu 元件。事实上,Alu 元件是人类基因组中丰度最高的转座元件。特别地,Alu 元件在人的基因 组中占比11%,在影响基因表达等方面影响广泛。Alu 元件基本组成模式如下: Part A--AAAAATACAAAAAA --Part B-polyA ,其中A 和B 序列往往类似。 但通常成环外显子两侧毗邻的内含子较大,其中包含的重复序列,如Alu 元件等也往往 是多个并存(图4 )。简单的原则是:距离最近的IRAlus 优先考虑。但实际的情形具体如何、 能否高效去除内源circRNA 的形成等问题还需要具体问题具体分析。 图4 circHIPK3 的基因组特征—两侧毗邻内含子中的重复序列(SINE )。 里面包含几十个SINE 元件,但具体哪个(哪些)介导了成环,需要谨慎的下结论(来源于circbase )。 二、 如何操作 在本文中我们以map circRNA 的IRAlus 为例,示例如何找到元件的边界,从而利 于下游的 CRISPR 操作(CRISPR 操作可以参考实验小白公众号系列文章 3 -shiyanxiaobai ): 已知:circRNA 的ID、序列 目的:Mapping 到两侧毗邻内含子中IRAlu (反向配对)序列 工具:Snapgene、RepeatMasker 、NCBI blast  circPOLR2A 的例子 1) circBase 调取hsa_circ_0000741 序列 可通过circBase 调取,方法请参考“circRNA 引物设计教程”。 2) 下载人POLR2A 基因的genebank 格式文件(.gb

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