常用分子实验步骤及原理.docxVIP

个人基因组DNA的分离和保存实验步骤1、轻微漱口，洗去口中的食物残渣。喝3ml蒸馏水并含在口中，让水填充于两颊之间，同时用牙齿轻刮脸颊内壁，30秒后将水收集到15ml的离心管中。2、往收集液中添加2ml的 lysis buffer，旋紧盖子，并轻轻地反转离心管5次，混匀反应试剂。3、往离心管中溶液加入500ul的蛋白酶和盐溶液，旋紧盖子，上下反转5次混匀反应物。将离心管放入50℃的水浴锅中恒温反应10分钟。4、将离心管倾斜45°，缓慢往管中加入10ml的冷的95%的乙醇（如果管内液体过多，可以在加入乙醇前分装或弃去部分液体），盖上盖子，将离心管正放静置于试管架中。5、轻轻地多次反转离心管使乙醇与与水溶液混合。6、用移液管小心将白色絮状物转移到小瓶子内，并尽量将小瓶子内的溶液吸出，最后加入75%的乙醇，并盖上小瓶子的盖子，串上绳子，制成DNA项链。个人DNA的多态性分析：PV92实验步骤及现象：实验步骤实验现象及原理Ⅰ、DNA模板的制备轻微漱口，洗去口中的食物残渣。喝约8ml的蒸馏水并含在口中，让水填充于两颊之间，同时用牙齿轻刮脸颊内壁，30秒后将水收集到15ml的离心管中。取1ml细胞悬液于1.5ml的离心管中，在12000转的情况下离心2分钟，离心时离心管的连接处一致向着外侧。离心后观察离心管底部沉淀物的大小，若小于火柴头大小则弃去上清液，重新加入1ml细胞悬液，再次离心。重复此步骤至沉淀物有火柴头大小。离心后吸出并弃去上清液，最后留下约50ul的上清液于离心管内。利用涡旋机重悬细胞至无块状细胞沉积。准备一个带有旋盖的1.5ml的离心管，并在其中加入200ul InstaGene matrix，将步骤c中获得的细胞悬液转移到带旋盖的离心管中，拧紧盖子。将带有细胞悬液的旋盖离心管放入56℃水浴锅中加热，5分钟后取出并再一次轻摇离心管，使沉淀重悬，再次放入水浴锅中加热5分钟。把离心管取出，再次轻轻涡旋，然后将离心管放入95℃的水浴锅中加热5分钟，取出后再一次进行轻柔的涡旋。将离心管放入离心机在在12000转的情况下离心5分钟。DNA的模板溶解于上清液中。将离心管至于冰盒中保存。各步骤中的现象及原理为：2. 中保证离心后的细胞沉积有火柴头大小是为了保证后续试验中有足够的DNA量；离心管连接端向外，可以易于观察细胞沉积，细胞沉积位于连接端下方。3．涡旋后形成细胞悬液，有利于InstaGene matrix与细胞混合反应。4. 使用旋盖离心管可以防止在水浴的过程中由于管内气压的增大而顶开盖子。5. 在水浴后可以观察到颗粒较为均匀的颗粒物，在加热过程中取出并重悬，这是为了使InstaGene matrix与细胞更好地混合反应。6. 水浴反应完毕后离心管底部仍可观察到白色沉淀物；轻轻涡旋后与95℃水浴5分钟是为了灭活蛋白酶使之变性析出，同时温度升高可以提高DNA的溶解度。7. 离心后离心管底部有两层沉淀物，一层为白色，位于最底部，一层为半透膜，覆盖于白色沉淀上方，最上方的DNA溶液为无色透明液体Ⅱ、PCR取出一个PCR管，吸取10ul的DNA的模板溶液到管中，再用移液管吸取10ul的master mix并转移到PCR管中，用移液管吹打混合2~3次，盖紧盖子。将PCR管放入PCR仪中，调设好PCR的程序如下：初始变性： 94℃下运行2分钟；40个循环扩增：94℃下变性1分钟，60℃下退火1分钟，72℃下延伸2分钟；最后一次延长为：72℃下进行10分钟；最后降温至15摄氏度下保存。master mix为黄色透明液体。用移液管吹打有利于DNA与master mix的混匀。PCR的原理见实验原理。在此步反应前应该要注意盖紧PCR反应管。以防止在PCR过程中内容物的蒸发。PCR完成后管内观察不到明显的现象变化。Ⅲ、琼脂糖凝胶电泳称取0.5g琼脂糖加入锥形瓶中，往锥形瓶中加入50mlTAE，摇晃混匀，用保鲜膜封住锥形瓶口，并在封口处开几个小洞。将锥形瓶放入微波炉中加热，加热每隔一段时间可以取出锥形瓶轻轻晃动，防止其在加热时爆沸，加热至溶液沸腾并完全澄清透明后即可停止加热。将琼脂胶于室温中降温至60℃左右即可进行倒胶。在倒胶前要清洗并擦干、固定模具放置好样品槽梳齿。倒胶时要注意胶面要没过样品槽梳齿最下端约2mm，并尽量使胶面水平。将琼脂胶于室温下冷却凝固，凝固后可以轻轻取出样品槽梳齿。将胶置于电泳槽中，加样的一端靠近负极，加入TAE缓冲液使之没过加样孔。分别吸取9滴每滴5ul的加样缓冲液排列于塑料膜上，每一滴加样缓冲液分别与5ul的DNA marker、+/+、+/-、-/-、蒸馏水以及四名实验者的PCR产物DNA混合。将每一滴混合液分别吸取10ul滴加到加样孔中。设置电压为250伏，电泳至示踪染料迁移至长度约为的2/3位置即停止电泳。小心将胶取出至透