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从质谱数据鉴定多肽/蛋白质 Key advantage of proteomics Researchers work on the level of gene products and deal with genes that are really expressed to give a detectable PRODUCT and are not just expressed“ which only says they produce a detectable mRNA but it is not clear whether there is a gene product or not. Key limitation of proteomics Usually, only a fraction of the proteins synthesized can be detected in a proteomics experiment, whereas the expression of ALL genes can be monitored in a whole-genome array experiment. Key prerequisite of proteomics A genome sequence for the investigated organism or at least a collection of many cDNA sequences is required. MALDI m/z spectrum of a peptide mixture The Quadrupole Ion Trap Mass Analyzer Fourier Transform MS 讲座大纲 本讲座中，将讲述三种鉴定蛋白质的方法。 1。质量纹鉴定法（Peptide Mass Fingerprinting） 2。二级质谱的手工鉴定法（De novo Sequencing)。 3。二级质谱的数据库搜索鉴定法（MS/MS Database Searching）。 鉴定多肽的流程 多肽质量纹鉴定 多肽质量纹（Peptide Mass Fingerprinting，PMF）是从一级质谱（MS）中鉴定多肽的主要方法。 多肽质量纹一般都用于分析2DE-MS的结果，不适宜分析多个蛋白质的混合物。 其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息。 一级质谱图 蛋白质经过酶解后，送入质谱仪，得到一级质谱。 从一级质谱鉴定蛋白质的算法（质量纹）主要用在MALDI-TOF产生的质谱图上。 目前来说，由MALDI-TOF质谱仪产生的质谱图精度较高。 另一个问题是，ESI产生的质谱图中的离子通常带有很多电荷，而MALDI质谱图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算。 蛋白序列数据库 在网上可以查询到最新的蛋白序列数据库，如IPI，swissprot等等 下载FASTA格式 Protein sequence database Uniprot（包含Swissprot和Tremble） Integr8 FASTA格式的数据库 FASTA格式包含蛋白的名称和氨基酸序列。 虚拟酶解 有了蛋白序列的信息，我们就可以进行鉴定。 对应于送进质谱仪的样品，首先找到数据库里的序列的酶切位点。 质量排列 这样可以产生一系列的多肽，我们可以计算每个多肽的分子量。 最后一个R的质量多加了18，这是因为我们写在下面的是残基的分子量。 质量排列 把所有多肽的分子量排序。 质量纹 如此，质谱图上的质量就可以与多肽上的质量相匹配。 质量纹 这就是多肽质量纹（PMF）的最基础的思路。 但是，真正的将之作为一个鉴定蛋白质的方法，还有很多需要考虑的问题。 PMF中的问题 第一个问题：质量相近的多肽怎么处理？ 在现实的蛋白数据库中，多肽的数量是很庞大的。这里面难保不会有质量非常相近的多肽。这样，就造成了质谱图上的一个峰可能匹配不止一个多肽，于是我们就难以知晓这张质谱图究竟代表哪个蛋白。 质量相近的多肽 解决方案 第一个解决的办法是限制用来搜索的数据库。比如，你如果做的试验用的是小鼠的组织，那么你可以只在小鼠的数据库中搜索，这样就可以减低出现这种情况的可能性。 第二个解决的办法是要求必须有多个多肽和数据库相匹配，才做出最后的蛋白质鉴定。 多匹配 长蛋白和短蛋白 第二个问题：长蛋白可能会更容易的被匹配。 因为长蛋白里的多肽数目较多，以概率来算，匹配上的几率也会比较大。 质量纹算法必须考虑这个问题，给短蛋白一定的补偿。 多个蛋白的情况 第三个问题就是在一张质谱图中可能有多个蛋白存在。 通常，MALDI-TOF是与双向电泳连接使用。双向电泳的一个电泳点上可能有2-3个蛋