色氨酸对猪原代肝细胞IGFⅠ分泌及表达的调控研究.pdfVIP

2004学术年会 色氨酸对猪原代肝细胞IGF—1分泌及表达的调控8 丁玉华1，李德发2，尹靖东2，朴香淑2 摘要：采用Seglen改艮的胶原酶两步原位肝脏灌注法，分离获取猪原代肝细胞。分剐用含0，4， 16，48 h后)，8， mg／L色氨酸浓度的无血清培养液培养肝细胞，培养o(用含血清的DMEM培养24 16，24h每处理取lmL培养液，用IRMA法测定溶液中的IGF-I浓度；培养24h后收集细胞，用 Tfizol提取总RNA，斑点杂交检测I(3F．I、GHR、IGF．I受体与IGFBP．3h mRNA丰度。在培养0 和8h后，各处理IGF-I的浓度无显著差异；在16 h时，0与4mg／L处理组IGF—I水平显著低于 mRNA 丰度则降低(P0．01)。相关分析表明，色氨酸浓度与IGF-I、GHR、IGF-ImRNA水平呈正相关 显著影响了肝细胞IGF．I浓度与IGF系统基因表达，说明色氨酸直接抑制或促进了肝脏IGF。I的分 泌马释放， 关键词：色氨酸，原代肝细胞，IGF．I，类胰岛素生长因子系统，基因表达，猪 1前言 肝细胞培养基中除去色氨酸，IGF-I mRNA水平及IGF—1分泌量均降低，这说明色氨酸可调节体内 组织IGF．I转录水平的表达。研究表明，色氨酸直接地或通过降低采食量间接地调节了IGF—I的合 成与分泌。但该饲养试验研究只是做了接近于动物生产的大群饲养试验，没有进行控制采食的配对 试验从而把采食量效应从色氨酸因子的影响中剖分出来。为了进一步探讨色氨酸对类胰岛素生长因 子系统基因表达的直接调控效应，本试验用不同色氨酸浓度的培养液培养猪原代肝细胞，检测不同 时间点IGF_I浓度，并收集细胞，提取总RNA测定IGD 达，在体外阐明色氨酸直接影响生长的机理。 2材料与方法 仪器设备主要包括紫外清洁型C02培养箱，生物安全柜，细胞培养用倒置显微镜，电热恒温水 槽，光密度扫描仪，紫#b／可见光分光光度计，梯度基因扩增仪(PCR仪)，电泳仪，圆筒式不锈钢 +国家自然科学基金资助项目，项目编号 2004学术年会 过滤秣，杂交炉，凝胶成像分析系统等。试剂主要包括DMEM，转铁蛋白，胰岛素(牛胰岛素，Sigma)， 胶原酶I，亚油酸，胎牛血清15种用于细胞培养的氨基酸(纯度95～99％)等。制备超纯水，将 7 mL超纯水中，搅拌使之完全溶解；加3 水加温至15～30。C；取13．5DMEM千粉溶入700 g g mL含lo万nJ，mL的双抗母液：0．22 NaHCO，，加超纯水定容至1000mL；加入1 gm微孔滤膜滤 mmol／L mmol／L 过除菌；最后用1 HCl或1 NaOH调节pH值至7．2。使用时加入10％胎牛血清则变 mL无 为含lo％胎牛血清的DMEM完全培养液。将氨基酸与维生素等营养成分与药品依次溶于750 菌超纯水中(待前一种试剂溶解完全后再加入另一种)，混匀补充水至1000mL，配制成不含色氨酸 的无血清DMEM培养液。使用前，分别加入0，4，16，48 InL不含色氨酸