犬瘟热病毒RTPCR方法的建立及部分序列的测定研究.pdfVIP

犬瘟热病毒RT—PCR方法的建立及部分 序列的测定 陈万荣1周育森1付少才2杨丽2 1军事医学科学院微生物流行病研究所2北京京西动物医院 毒，在幼犬中本病的死亡率较任何其他传染病为高。犬瘟热一直是近几年来发病率最高、 死亡率最多、危害最为严重的犬传染病之一，根据报道11Ⅲ动物医院门诊就诊率比其他传染 病高。太瘟热也是水貂的一种传染病。又称貂瘟，死亡率也很高，引起严重的经济损失。该 病毒属副粘病毒科、麻疹病毒属，是一种非重叠的负链RNA，由15616个核苷酸组成。目前 对该病度的检测方法有ELISA荧光试验法和血凝试验法等，但用基因诊断方法诊断CDV感 染国内报道甚少，我们建立了从病犬粪便、血液和体外细胞培养标本中提取RNA，用RT— PCR方法扩增到产物。并进行了部分基因序列测定，现将实验报告如下。 1材料和方法 1．1材料来源 血清、粪便标本采自北京京西动物医院门诊病犬，根据临床表现和ELISA方法诊断为犬 瘟热病毒感染，体外细胞培养标本经反复冻融3次，3000rpn∥5分钟取上清液80。C备用。T 上海博亚公司合成并进行序列测定。 1．2引物设计及PCR扩增条件 AC-GACC— 引物设计参考文献[2]CDV—OND株的序列，Pl引物为：5’ACAGGATIV,CTG TAT3’，P2引物为：3’CAAGATAACCA’mT^CG删5’。 1．3CDVRNA提取 取血清、粪便悬液和CDV细胞培养液100td加人到O．5ml离心管内，加人120ul变性液， 中，再加入75u1异丙醇，振荡均匀，室温或一20。c放置沉淀1小时或过夜。13000rpm／10 分钟离心，吸去上清，加入300山一400ul预冷的65％乙醇，轻轻振荡混匀，室温13000转离 心5分钟，吸取上清，室温放置10分钟凉千，在离心管内加人15ul无菌水，90。C加热5分 钟振荡混匀，室温13000rpm／5分钟离心，保存用于PCR扩增。 I．4CDVILNA反转录 0．6ul， 各取提取的CDVRNAlul每个管内加入5xvrBuffer4ul，25mMdNTP0．1ul，AMV 扩增。 1．5eDNA PCR扩增 10xPCR缓冲液，引物浓度为．01umol／L、dNTPsO． 扩增条件：各取8uleDNA作模板，3ul 179 08umol／L、Taq酶每个样品用2个单位，反应体积为30ul，94。C预交性180秒，舛。C35秒， 72。CA0秒，55。C35秒，72。c延伸5—10分钟，扩增35个循环，用l％琼脂糖凝胶电泳，紫 外灯下观察PER扩增带。 1．6PCR产物的克隆测序 扩增出阳性的PcR产物，直接于PGEM—T载体连接，转化XLI—Blue宿主菌，挑取白色 茵落用PCR鉴定。对阳性菌落接种培养，提取质粒DNA，单链测序。 2结果 2．1RT—PcR扩增 根据文献报道[2]已知CDV—OND部分序列，合成一对引物。分别对病犬血清、粪便和 细胞培养分离标本进行RNA提取，经RT—PER扩增对其产物进行电泳分析，分别在287bp 部位出现一条带，而正常粪便、血清和细胞培养液未见带(图1)。 2pcR产物的测定 一 对细胞培养分离标本的PER扩增产物，经pOEM—T载体连接、转化和克隆后测定了该 片段的序列，该序列与文献报道的CDV—OND株和CDV—Rock探对应位置的核苷酸和氨基 酸同源性为96％一97％(图2) 3讨论 犬瘟热病毒的RT—PC,R研究国外文献报道的较多，国内文献较少，1999年FRISK，A 上．等报道了用RT～PCR方法，从病犬的血清、全血和脑积液中分别扩增到CDV基因，并进 行了部分序列测定，表明具有较好的敏感性和特异性。我们按文献的方法合成一对引物， 用RT—PCR方法，从病犬