猪α干扰素原核表达的研讨.pdfVIP

摘要 目前，猪的病毒性传染病愈来愈复杂、越来越严重，且尚无有效 化学药物或制剂，而疫苗的使用又存在着诸多不足和隐患，严重影响 了养猪业的发展。基于这个原因，本论文对抗病毒作用广谱、效果显 著的细胞因子一一猪A一千扰素(interferonIFN)进行了研究，以期能将 之应用于预防和治疗猪的病毒性传染病 通过检索GenBank上的核昔酸序列，设计了一对简并引物，直接 以长白猪的肝组织染色体基因为模板进行PCR扩增，特异性地获得一 条大小约为500bp的DNA条带。用T-A克隆方法，将PCR产物与 pMD18-T载体连接，成功构建了猪A一干扰素重组质粒pMDIFN-Ae 经核酸序列比较和酶切鉴定，确证克隆基因为猪a一干扰素基因 (pIFN-A)。该基因由501个核昔酸组成，编码166个氨基酸。与GenBank 上序列号为M28623.X57191的猪。一干扰素基因比较后发现，它们之 间的同源性分别高达 98%和 97.8%，且只存在点突变，以第 110-130 位碱基的变异较大。推导的氨基酸序列显示，克隆基因与M28623和 X57191均编码 166个氨基酸，它们之间存在着无义变异，变异率为 4.2%. 重组质粒pMDIFN-A中的猪。一干扰素基因经双酶切，亚克隆到原 核表达载体pET-28a，构建了重组表达质粒pETIFN-A.IPTG诱导后 的重组子经过SDS蛋白质电泳，测得表达蛋白的相对分子量约 为26.5KDo 在对表达蛋白进行Western-blotting分析，以检测表达蛋白的免 疫学特性的试验过程中，本研究对常规的Western-blotting方法进行了 改进:① 转移后的硝酸纤维膜作了除SDS处理;② 所有孵育温度由 室温或37℃改为了4*C，从而提高了特异性、降低了本底;③ 为了提 高免疫印迹的灵敏度，将酶标二抗改为生物素化二抗，联合 ABC(Avidin-biotin-PeroxidaseComplex)试剂盒进行逐级放大;④ 用 WesternMarke:作Western-blotting检测的阳性对照。表达蛋白的 Western-blotting分析显示:改进后的半干胶转印免疫印迹法灵敏度高、 特异性强、重复性好;获得的重组融合蛋白具有良好的反应原性。 超声波、酶裂解等多种方法相结合，提取包涵体，再用透析法复 性，按 is500浓缩，获干扰素原液。以该制剂处理非洲绿猴肾细胞 (VERO)，没有发现明显的毒性作用。经细胞病变抑制法((CPE50)测定， 该表达干扰素能抑制水泡性口炎病毒的增殖，效价为2-3.78. 结果显示大肠杆菌表达的猪。一干扰素是具有应用潜力的抗病毒 生物工程制剂。 关键词:猪A一干扰素，基因克隆，原核表达，免疫印迹，复性，抗病 毒活性 it 本论文常用缩写词 Amp Ampicillin 氨节青霉素 Kan Kannmycinsulfate 硫酸卡那霉素 IPTG Isopropyl-P-D-Thiogalactoside 异丙基硫代一p-D一半乳搪昔 DTT 1,4-Dithiothreitol 二硫苏糖醇 TMEMD N,N,N,N-tetramethylethylenediamine N,N,N,N，一四甲基乙二胺 PMSF phenylmethysulfonylfluoride 苯甲基磺酞氟 x-gal 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-R-D- 5-澳-4-氯-3-011噪一s-D-半乳糖普 Galactoside SDS SodiumDodecylSulphate 十二烷基磺酸钠 Basepair 碱基对 Ethidiumbromide 澳化乙锭 EDTA Ethylenediaminetetraaceticacid 乙二胺四乙酸 D