猪γ干扰素的分子克隆与在大肠杆菌中的表达研究.pdfVIP

976囝2004学术年会 猪Y一干扰素的分子克隆与在大肠杆菌中的表达 姚清侠，钱平，李祥敏，徐卓菲，郭东春，金梅林，陈焕春 华中农业大学动物病毒室，武汉430070 摘要：采用RT．PCR技术从猪血淋巴细胞总RNA中扩增出猪干扰素vcDNA(SwlFN—v)。将 其克隆到pMDl8一T载体中，经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的SwlFN—v与已报道的猪Y 主茵不同时间的诱导摸索出最佳表达时间，经IPTG诱导后，得到高效表迭。包涵体纯化、变性、 复性后经细胞病变抑制法测定结果表明重组猪IFN—v具有较强的生物学活性。 关键词：猪y干扰素；原核表达 码166个氨基酸，其中前23个氨基酸为信号肽，后143个氨基酸组成成熟蛋白，不含有半胱氨酸。 IFN．y是由活化的T细胞及NK细胞产生，具有抗病毒活性和强大的免疫调节作用，尤其对某些病 越来越多的研究表明IFN．Y不仅能有效抑制病毒增殖而且在细胞免疫中也起到了重要的作用。 本试验成功克隆了猪IFN—Y全基因，并构建了包含信号肽的原核表达载体，实现其高效表达， 并对融合表达蛋白的提取、变性和复性进行了初步研究，为重组猪干扰素的工程化生产及应用奠定 了基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1菌种和质粒 业大学生命科学院张忠明教授惠赠；大肠杆菌DH5。和BLz-为本室保存。 1．1．2细胞和病毒 ’ BHK．21细胞为本室保存；口蹄疫病毒(FMDv)为本室分离毒种。 1．1．3酶及主要试；|{I PRIM I、BamH I和T4 DNA连接 剂盒RNA．SolV‘Reagent购自美国OMEGA公司；限制性内切酶EcoR 酶均购自TaKaRa公司。 1．2方法 1．2．1猪外周血白细胞的分离及诱导培养 无菌采取抗凝的猪外周血10ml，取5ml外周血．RPMI1640倾斜45。慢慢加入已加有5ml淋巴 细胞分离液的试管中，2000rpm离心lOmin。无菌条件下弃上层吸取中问浅色带的淋巴细胞层；加 灭菌PBS(pH 2004学术年会 10％小牛血清的RPMI 为15u毋7ml，置5％CO,，、37℃培养。 1．2．2猪Y．干扰素总RNA的提取 胞总RNA，作为RT—PCR的模板。 1．2．3引物设计 cDNA序列(AF493993)，设计下列引物： 根据GenBank上发布的polFN—y i) PI：5-tt＆atcctccgaaacaatgagttatac一3’(BamH l 1 P2：5’一tt醴gatgacaattattttgatgc一3’(EcoR 1．2．4 cDNA的克隆和测序 poIFN．Y cDNA的条件：总 以猪外周血白细胞总RNA作为反转录的模板，一步法RT-PCR扩增全长polFN-Y 体积为50u1，10×one stepRNAPCRBuffer dNTP RNase AMV Mixture Inhibitor 5ul，25mMMgcl210”l，10raM 5”1舯u舡l l山，5 U／pl XL RTase AMV-Opami,edTaq1¨l，P11¨lB