猪带绦虫45W4B基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及45W蛋白结构和功能的初步研讨.pdfVIP

猪带绦虫45W-4B基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及 45W蛋白结构和功能的初步研究 摘 要 猪带绦虫45W基因家族是由一群结构和功能相似的基因组成的。45W基因在反式 剪接作用下产生A,B和C三型转录本，其中A型转录本是由外显子I、IIIIII和W 组成:B型转录本由I、m和N组成;C型转录本由I和N组成，在不同的转录本中 的同一外显子有高度的同源性，也存在变异。 45W基因己被认为是预防猪囊尾黝病的基因工程疫苗侯选基因之一。本试验成功 地从六钩蝴中克隆到4B基因。通过对4B基因序列的比较，发现4B基团是45W基因 中较为特殊的一个基因，该基因与45W其他相关基因之间变异范围为17.896-20.696, 但该基因在不同虫株间和不同克隆间高度保守。为了研究4B蛋白的结构和功能，并 为研制和开发有效的猪带绦虫基因工程疫苗打下基础，本研究将4B基因及其3端的 剪切片段克隆到pET-28a载体中，并在大肠杆菌BL21中成功地表达，与预期分子大 小一致，为18kDa，经Westernblot检测，表达的重组蛋白能被猪囊尾拗病人血清 识别，为开发高效猪囊尾蝴基因工程疫苗打下了基础。 45W基因的这独特的交替剪接形式引起了寄生虫学家们的广泛兴趣。为了研究 4B蛋白在猪囊尾蝴组织中的结构和功能，试验中利用大肠杆菌表达系统表达的4B重 组蛋白，分子量约为 18kDa，腹腔注射免疫小白鼠，经两次免疫后，采血，并用该 血清与猪囊尾勤组织匀浆蛋白做免疫印迹，发现在50kDa处有一明显的印迹条带， 而18kDa处没有。表明在猪囊尾蝴组织蛋白中45W蛋白各型蛋白可能以同型或异型 寡聚体形式存在。用计算机软件分析发现4B蛋白的抗原性很好，用蛋白质结构数据 库 (ProteinDataBase,PDB)比较，发现4B蛋白(包括45W其他型)存在纤连蛋 白(Fibronectin,FN)结构域。45W蛋白寡聚体形式组成与纤链蛋白的组织构成十 分相似，推测45W蛋白与猪囊尾蝴囊壁的形成有关。 家蚕表达系统通过将外源目的基因插入家蚕核多角体病毒 (BmNPV)多角体启动 子 (polyhedrinpromoter)的下游，外源基因利用多角体启动子进行转录表达，并 分泌到细胞外，从而在细胞上清获得重组目的蛋白。家蚕表达系统 (silkworm baculovirusexpressionvectorsystem,BEVS)表达的目的蛋白能够进行正确的 加工、修饰，使目的蛋白更接近于天然蛋白。同时家蚕细胞能识别哺乳动物的分泌 蛋白的信号肤序列。4B基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中，通过与家蚕 杆状病毒(Bom句xmorinuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV)在家蚕Bm细胞中共 转染，重组到BmNPV中，通过筛选纯化，获得重组病毒。重组病毒感染家蚕细胞和5 龄家蚕，表达4B蛋白，分子盆约为16kDa，与预测的大小相吻合。并用Westernblot 鉴定该重组蛋白能识别猪囊虫病人 (猪)阳性血清。4B基因在家蚕细胞中的表达对 进一步研究45W基因的结构功能，并开发出更可行、方便的基因工程疫苗打下基础。 关键词:猪带绦虫;45W基因;pET-28a;pVL1393;表达 Expressionof45W-4BGeneofTaeniasoliuminE.coliandBmNPV-Bm SystemandStudiesontheStructureandFunctionof45WProtein Abstract 45WgenefamilyofTaeniasoliumconstitutesofagroupofgenesthathavefamiliar structureand丘inction.Threetypesof45WgenesofT.solium,Atype,BtypeandCtype wereproducedthroughalternativesplicing.Atranscriptiscomposedofthefourexons I，II，IIIandN,Brtanscriptislackofexon11,andCtranscriptislackofexonsII andIII.Thesameexonbetweendifferentgenesishi蒯yhomologous,buts