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2018-1-2 1 第七章 色谱法 薄 层 色 谱 法 2018-1-2 2 概 述 1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。 2018-1-2 3 薄层色谱与高效液相色谱的差别（特点） 固定相和流动相 TLC——流动相流动靠毛细作用力，流动相选择较少受限制，固定相不用再生。而 HPLC是在封闭的系统内，流动相流量靠泵控制，溶剂选择受检测器限制，固定相需再生。 样品处理 TLC要求没有HPLC严格。 2018-1-2 4 色谱分离 TLC可同时分离多个样品，并可采用相同或不同溶剂进行同向或双相多次展开，通常采用正相色谱，色谱后衍生化方便。 HPLC一次只能分离一个样品，通常采用反相色谱，色谱后衍生化受限制。 对污染物抗受力强 TLC——颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均无影响。 HPLC—— 颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均有大的影响。 2018-1-2 5 薄层色谱系统 薄层板 未改性固定相 硅胶—为使用最广泛的薄层材料 氧化铝—有碱性、中性、酸性 硅藻土—为化学中性吸附剂 纤维素—天然多糖类 聚酰胺—为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性。 2018-1-2 6 表面改性固定相 疏水改性硅胶——化学键合烷基 亲水改性硅胶——引入氨基、氰基、二羟基等，薄层板极性介于极性吸附剂和疏水改性剂之间（极性次序：硅胶﹥氨基﹥氰基﹥二羟基﹥ 反相）。 表面改性纤维素——乙酰化纤维素 药典收载的固定相有：硅胶类、硅藻土类、氧化铝类、微晶纤维素类等。颗粒直径一般要求10 – 40 um。 2018-1-2 8 有机黏结剂——羧甲基纤维素钠（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。 荧光黏结剂——在吸附剂中添加某种荧光指示剂，常用的荧光指示剂 在254nm紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光素、硫化镉、阴极绿等。 在366nm有荧光的指示剂如彩蓝等。 含有荧光指示剂的商品吸附剂以“F”表示，并以下标注明其激发光波长。例 硅胶HF254 2018-1-2 9 薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂。例： 硅胶板（粒度10 ～40um） 硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。 硅胶或硅胶G ——以CMC为黏合剂。配制0.2% ～ 0.7%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。 2018-1-2 10 反相薄层板制备——以不同链长的 正构烷烃为固定液, 配制成适当浓度的溶液(如5%硅酮油乙醚溶液), 浸渍硅胶板。 薄层板活化 涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如： 硅胶 110℃ 1h 氧化铝 110℃ 30min 2018-1-2 11 铺层（湿法和干法） 湿法铺层条件及方法 类别 吸附剂∶水 粘合剂 活化 硅胶G 硅胶H 氧化铝G 氧化铝-淀粉 硅胶 硅胶-淀粉 硅藻土 纤维素 聚酰胺 1∶2~3 1 ∶2~3 1 ∶2 1 ∶2 1 ∶2 1 ∶2 1 ∶2 1 ∶5 溶于5%甲酸， 加70%乙醇 不加 加 不加 不加 加0.7%CMC 不加 不加 不加 不加 110℃，0.5h以上 110 ℃，0.5h以上 250 ℃，4h以上（II） 150 ℃，4h（II~III） 110 ℃，0.5h 110 ℃,0.5h 105 ℃,0.5h 105 ℃,0.5h 105 ℃,0.5h 80 ℃,15min 2018-1-2 12 点样 要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。 采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。 点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。 手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul），微量注射器。 2018-1-2 13 自动点样 Limomat IV 喷样仪——样品溶液通过气流成雾状喷向薄层，移动板台，使在薄层上流下样品条带。 特点：适合于大量稀样品溶液的喷加；条