酶解技术原理详解.doc

酶解技术原理详解 ?第一步，脱色。考染条带用NH4HCO3缓冲液/30%-50%有机溶剂（一般是乙腈）25mmol/L的NH4HCO3的50%的乙腈。多次水浴超声至胶粒无色，盐离子/有机溶剂的组成同时降低染料和蛋白的盐键和疏水相互作用。银染条带用铁氰化钾或过氧化氢和硫代硫酸钠的混合溶液与胶粒充分混合，胶粒颜色脱去后，用超纯水洗至无色。铁氰化钾或双氧水氧化银颗粒，产生的银离子与硫代硫酸钠形成复合物除去。10%的蛋白可能在这一步损失。 第二步，二硫键还原和烷基化。为了让typsin充分的接近切割位点，并让酶切后的肽段彼此分开。酶切之前用DTT还原二硫键，并用碘代乙酰胺（IAM）将巯基转化为-CH2-CONH2，防止打开的二硫键再结合。打开并还原二硫键可以提高酶切的效率和质谱检测的灵敏度，这一步不是必须的，在某些情况下（比如说蛋白主链对DTT处理敏感），可以省略。为了定量和均一的烷基化二硫键，IAM的处理时间很关键，不多不少45分钟，一分钟都不要差！IAM对光敏感，分装成小份保存在-20℃，配制和加入都应快速避光，反应在暗处进行，最好是用铝箔纸把管子包起来，如果IAM溶液呈粉红色，说明已降解，就不要用了，IAM的光解产物对蛋白有不良影响。 第三步：胶内酶解：typsin是最常用的酶typsin的切割位点在碱性氨基酸(Arg, Lys)的C端，切割位点一侧有酸性氨基酸会降低酶切效率，如果是Pro则完全阻止酶切。其他酶还有endoproteases Lys-C, Glu-C [29][30][31], Asp-N，它们的名称代表酶切的位点，如Asp-N在Asp残基的N端切割。这些酶的切割仅依赖于一个氨基酸的识别，比起typsin，可降低长肽段产生的概率。 typsin的一个缺点是它的自切割活性，酶分子之间“自相残杀”，产生的肽段干扰质谱结果。最初是通过加入钙离子避免这个问题。现在我们用的typsin是修饰过的，在Lys上甲基化，一定程度上限制了自切割。修饰后的typsin最适反应温度由35～45℃上升为50～55℃。 我们让酶进入胶内的方法是胶块用乙腈脱水，然后在酶液中泡胀，冰上放置后吸去多余酶液以避免过多的酶自切割造成背景。对于酶分子进入胶块的机制说法不一，大多数人相信酶液可以随着胶块泡胀进入胶内，但是有实验证明酶分子完全靠渗透作用进入胶内，要提高渗透的效率，把胶块切小是个好办法。一般胶块泡胀半小时已足够，但是要让酶分子扩散进入，最好放两个小时，这个过程中一定要严格低温，否则酶这时候开始消化，造成肽段损失。酶切条件：37℃过夜（约12～15 h）。如果不想过夜，可以提高反应温度，55℃半小时就可以。在最适的温度和pH下，完全消化可以在30 min内完成。 水浴加热过夜水分会蒸发凝结在管盖上，所以加的缓冲液可以比淹没胶块多10～20ul，如有可能，最好空气加热。 表面活性剂的加入：表面活性剂可以提高蛋白的可溶性，变性蛋白，暴露酶切位点，有利于蛋白酶的接近，如果你的蛋白是疏水性的，如膜蛋白，这一点就有用了。Cleavable detergents是一种在一定条件（通常是酸性）下可以降解的表面活性剂，不干扰后续的质谱鉴定。 第四步：肽段抽提。在酶解的过程中，会有一些肽段从胶里游离出来。过夜酶切的缓冲液加入0.1%甲酸终止酶切后（typsin在酸性条件下失活），液相部分被吸出来保存。胶块中的肽段用含一定比例的乙腈的缓冲液反复超声萃取，疏水性有机溶剂和离子的萃取液保证了亲水和疏水的肽段都能被萃取出来。第一次萃取能够回收大多数肽段，重复的萃取大约提高5-10%产率。有的时候，为了提高酸性/碱性肽段的抽提效率，胶块分别用NH4CO3缓冲液和低浓度的甲酸萃取。 第五步：真空干燥。合并最初的消化buffer和各次萃取液，真空离心抽干。LC/MS样品用0.1%甲酸溶解，MALID-TOF样品用0.1%TFA溶液溶解。由于萃取体系中含不同比例的乙腈和水，抽干的时间似乎不和液体体积成比例，可能是因为乙腈和水以一定比例混合后，达到平衡状态，此时气化最慢。（100 ul的纯乙腈和水不到半小时就能抽干，而我的样品在最初30分钟内由200 ul减至100 ul，接下去的完全抽干要1～2h）建议a.将样品在-20℃冻结后再抽干；b.蒸发进行到“困难”阶段时，往体系中加一点超纯水，破坏平衡再干燥。抽干后的肽段一般是看不见的，重溶时要将液滴在管壁上滚动几圈，避免肽段粘附在壁上损失。 注意事项 质谱兼容的银染：银染的方法有上百种，选用时注意是否会干扰质谱结果。我用的是AMERSHAM的方法，敏化不加戊二醛，染色时不加甲醛，在显色时加。（戊二醛造成蛋白交联而低浓度甲醛不会。） 使用的缓冲液：In-gel digestion时使用的NH4HCO3缓冲液，提供弱碱性环境，pH值