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第八章 未可培养海洋微生物 8.1未可培养海洋微生物 未可培养海洋微生物是指那些栖息于海洋环境中，用现有培养方法还不能得到纯培养的微生物。 对微生物生命活动及其生长环境认识不足。 对未可培养海洋微生物的认识始终处于动态的变化之中。 8.2未可培养海洋微生物的多样性 20世纪90年代分子生物学技术应用于海洋微生物多样性研究以来，未可培养海洋微生物的多样性研究得到了迅猛发展。 广泛--细菌、古细菌、真菌、病毒以及原生生物等多个微生物门类。 早在1932年，Razumov报道在水生环境微生物的研究中，通过显微镜观察计数得到的细胞数远远大于各种培养基培养的菌落数，随后发现这种现象普遍存在。 伟大平板，计数太偏！ 对末可培养海洋浮游细菌进行分析，通过对GenBank中海洋浮游细菌的16S rDNA进行分析，获得1117个独特序列，其中609个来源于未可培养细菌，它们涵盖了变形细菌、浮霉菌、噬纤维菌一屈挠杆菌、厚壁茵、沈微茵、蓝细菌等类群，其中变形细菌中未可培养细菌所占比例最高，噬纤维菌一屈挠杆菌次之。 8.3 未可培养海洋微生物难以培养的原因 生境条件的改变 营养条件的变化 群落生存方式的破坏 微生物自身因素 8.3.1生境条件的改变 对微生物生境了解尚不充分。 不能完全模拟微生物的自然生存条件。 物理条件(温度、湿度、辐射、压力、磁场、空间、时间等)、化学条件(盐度、酸碱度、重金属浓度、氧化还原电位等)和生物条件(营养、种群密度、生物链因素等)。 将微生物置于恒温、恒温、黑暗或光照等小环境中。 对于大多数微生物而言，分离、纯化对微生物本身就是一种生态灾难，它们由于不能适应环境的变化而难以复苏形成菌落，从而导致微生物的不可培养。 8.3.2营养条件变化 营养过剩 营养物质缺失（丙氨酸运输系统） 特殊物质（ATP，1nmol/L），微藻分泌的生长因子和维生素。 8.3.3群落生存方式的破坏 微生物群落：特定生境中各种相互影响的微生物的总和。 环境压力：营养、代谢底物、环境污染、种间优势。 共同协作关系和群落感应。 单纯培养：缺乏必要的信息和物质交流 共同协作：生存环境胁迫而发展起来的微生物间协同生长的生长方式。 包括偏利共生、互惠共生关系 群体感应：近年来的研究证明细菌之间存在信息交流，许多细菌都能合成并释放一种被称为自诱导物质的信号分子（AI），胞外的AI浓度能随细菌密度的增加而增加，达到一个临界浓度时，AI能启动菌体中相关基因的表达，调控细菌的生物行为。如产生毒素、形成生物膜、产生抗生素、生成孢子、产生荧光等，以适应环境的变化，我们将这一现象称为群体感应调节。 8.3.4微生物自身因素 微生物培养在液体，而不能在平板上。 温度影响。 8.4 末可培养海洋微生物的培养技术 大力开发微生物培养技术，以提高微生物可培养性，不仅是微生物学基础理论研究的需要，也是未可培养海洋微生物资源开发利用的基础。 8.4.1稀释培养技术 8.4.2模拟自然培养技术 8.4.3富集培养技术 8.4.4混合培养技术 8.4.1 稀释培养技术 采用将营养基质稀释一定倍数的稀释培养技术，甚至直接采用原生态水作为培养基。 (1)细胞微囊法 (2)消失培养法 (1)细胞微囊法 细胞微囊法是由Zengler K于2002年首先报道，它是指把微生物细胞包装成微滴胶囊，通过其先后在含有低营养培养基的灭菌层析住中以及含有富营养培养基的微孔板上进行培养而分离微生物的一种方法。 (2)消失培养法 消失培养法：先用荧光显微镜对天然群落微生物直接计数。然后将样品稀释至终浓度为1-5cel/ml，接种到预备培养基；加入48孔板(1毫升/孔)中，培养一定时间后，各取200uL过滤排列在48片滤膜上，染色，并转移至载玻片上，用荧光显微镜观察，有微生物生长即为阳性；最后对阳性培养物进行 PCR、RFLP分析和测序鉴定，并进行保藏。 8.4.2 模拟自然培养技术 成功分离未可培养海洋微生物，就要连同它们所栖息的生境和群落一起带走，让培养条件模拟原先的自然状态。 (1)近自然纯培养法 近自然纯培养法：将微生物培养在内衬有微孔滤膜的有孔培养装置(如培养皿、试管和三角瓶等)中，并将装置放入微生物所需的真实环境或模拟自然生境的外皿中，内外环境中活性物质可通过微孔滤膜相互渗透，保证被培养的微生物能够同原生环境交流，克服传统纯培养难以提供外源活性物质的缺陷，从而提高未可培养海洋微生物的可培养性。 (2)扩散生长小室法 Kaeberlein T等(2002)设计了一种称为扩散生长小室的结构，用于海洋微生物的分离培养，这种小室允许营养物和微生物产生的活性物质透过膜进出小室，而细菌却不会逃逸。 具