5目的基因的制备.ppt

第五章 目的基因的制备;一 概 述;二 什么是目的基因 ;;第一节 目的基因的制备;1.1 限制性核酸内切酶酶切分离法;;;根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段;1.2.1.4 三种方法各有利弊 ;;O;;第一节 目的基因的制备;;2、从基因组文库中钓取目的基因;2.1.2 基因文库构建的材料来源;2.1.3 基因文库的完备性;For example : 期望值为0.99，插入片断为20kb的 E.coli (4.6×106 bp) 和 human (3×109 bp) 基因组的克隆数的计算 N E.coli= =1.1 ×103 ;2.1.4基因文库的质量标准;2.1.5基因文库的构建技术路线;2.1.5.1 基因组DNA的制备;2.1.5.2 载体的选择;2.1.5.3 载体与基因组DNA的切割;2.1.5.4 载体与外源片段的连接（1） 连接酶;（2）连接反应的效率;（3）避免外源DNA片段之间的连接措施;;2.1.5.5 重组DNA导入宿主及筛选;密集铺板（1-10万）;构建噬菌体基因组文库的主要步骤 ;用粘粒载体建立基因组文库的主要步骤;2.1.5.6 基因组文库重组克隆的排序;（1）酶切片段末端标记法;H;（2）随机探针联合杂交法;;;（3）染色体走读法（chromosome walking）;染色体走读法（chromosome walking）;染色体走读法（chromosome walking）;2.1.5.7 从基因组文库中钓取目的基因;（1）核酸杂交方法;（4）PCR筛选法;从24个反应板中找出具有阳性克隆的反应板，再将该板中的12个横向克隆与8个纵向克隆分别混合，形成12个横向池及8个纵向池，进行20个（8+12）反应，如图，横向阳性池与纵向阳性池交叉的孔为阳性单克隆，通过44个反应可从2304个克隆中筛选分离出单个克隆。;大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案;2.1.5.7从基因组文库中钓取目的基因总结图;第一节 目的基因的制备;3 从cDNA文库中钓取目的基因;3.1.1. cDNA;（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。;分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 ;;反转录酶;用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。;剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。;④去掉发卡结构;在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。;;3.2 cDNA克隆的操作流程;第一节 目的基因的制备;4 通过PCR直接扩增出目的基因;通过PCR直接扩增出目的基因策略;;4.1 套式 PCR（nested PCR）;4.2 反向 PCR(inverse PCR);首先，用限制性核酸内切酶消化待测线性DNA模板。 其次，使酶切后的线性 DNA 模板连接成为环状分子，或加上衔接头后再连接成环状。 第三，用另一种限制酶消化，将环状DNA从已知区域中间切开，则线性化DNA的两侧为已知序列，未知区域夹在中间，用与已知区域可使未知序列大量扩增出来。;4.3 锚定 PCR(anchored PCR);其基本步骤;4.4 反转录 PCR（RT-PCR）;第一 连续RT-PCR( 两阶段单管式 );第二 长距离 RT-PCR( 两阶段双管式 );4.5 锅柄 PCR（panhandle PCR）;锅柄 PCR实施步骤;;;第五章 目的基因的制备;第二节 目的基因的分离;第二节 目的基因的分离;第二节 目的基因的分离;1 目的基因的功能克隆筛选法;1.2 功能互补法克隆基因;第二节 目的基因的分离;2 序列克隆法筛选;把滤膜放在平板上，将噬菌斑中的噬菌体颗粒影印到滤膜上，使噬菌体DNA结合在滤膜上。把滤膜放入含有放射性标记的探针的溶液中杂交。杂交后洗去膜上非结合的探针，经放射自显影确定。然后根据 X 线片上的放射性位点寻找相应的噬菌斑，从而分离到与探针顺序互补的目的克隆。;2.2 表达序列标签法分离目的基因 ;2.2.2 基本步骤 ;3 筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术;;利用差别杂交法筛选生长因子调节基因图 ;局限性;3.2 减法杂交技术;3.2.1 mRNA 减法杂交;以 mRNA减法杂交为例，基本原理是