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_动物肝脏DNA提取和鉴定
动物肝脏中DNA的制备和鉴定;核酸的分类;核酸的理化性质; 浓盐法:利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。
离子去污剂法:利用SDS、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)等去污剂使蛋白质变性,直接从生物材料中提取DNA。
苯酚抽提法:苯酚既是蛋白变性剂,又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。
;核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷,结合带正电荷的蛋白质。用于
核酸提取的去垢剂,一般都是阴离子去垢剂。
去垢剂的作用:
1.溶解膜蛋白及脂肪,使细胞膜破裂;
2.溶解核糖体上面的蛋白质,使其解聚,将核酸释放出来;
3.对RNase、DNase有一定的抑制作用。; 作用:
1.使蛋白质变性、沉淀,从核酸提取液中分离除去,以防造成蛋白污染。
2.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。
;核酸提取的主要步骤;注意事项;1、学习并掌握用浓盐法从动物组织中的提取DNA方法及其原理。
2、学习和掌握二苯胺法测定DNA的原理和方法。
;二、实验原理; 核酸含量的测定方法:紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。
脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物,在595nm处有最大的吸收 。
DNA20~400微克范围内,光密度与DNA的浓度成正比,在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应的灵敏度。
;三、实验试剂;组织捣碎匀浆机 ;猪肝8g;;除去蛋白质的方法 ;DNA的定量测定;DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml,作为待测品。
;以吸光度A595nm对DNA含量(ug)作图,
绘制标准曲线。
从标准曲线上查出样品的DNA含量。
计算100g猪肝中DNA的含量:
待测样品中DNA的质量×25(稀释倍数)
称取猪肝的质量; 匀浆(破碎细胞)要充分,需剪成小块。
固体NaCl应磨碎,加入应分批缓慢加入,边加边摇,避免局部浓度过大或者未及溶解而沉入氯仿层。
变性蛋白质层易散,吸取上清液时应仔细,不要???蛋白质及下层的氯仿吸入。
实验结束后将变性的蛋白质(肝糜)小心取出置于专用的废物袋中,氯仿倒入回收瓶内。
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