03 2011硕士分生实验——转化 2011.11 (袁野).pptVIP

将重组DNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。 细菌细胞能摄取外来DNA的生理状态称为感受态。 受体菌的改造与选择 限制与修饰系统：R-,M-或R-,M+的突变体，（R：restriction; M: modification）突变问题 重组系统：选用rec+的转化（提高转化效率），再转到rec-受体菌中保存（防止整合到染色体DNA基因组中去）。 选择能够发展成为感受态细胞的菌株做受体菌：肺炎双球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母系统。 根据ori选择受体细胞。 空菌? 不耐药？ 电击法:将细菌置入一定的容器内，通入高脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成功效率高，可达1010/1ugDNA，但细胞容易死亡，约一半以上的细胞死亡。 化学法：如：Ca2+、DMSO、还原剂、氯化六氨合高钴等，成功率可达105-8/ug DNA。 6. 制备感受态菌时期选择： 细菌生长时相 转化最佳时期应选择在对数生长期的后期。OD550nm=0.2-0.3 （5-6?108细胞/ml） * * 基因工程的基本过程 分 切 接 转 筛 表 转 化 Transformation 感受态细菌的制备及转化实验 Department of biochemistry and Molecular Biology Yuan Ye 基本原理 然界的转化： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记基因，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 载体的选择标准: 受体菌的改造与选择 感受态菌制备方法 原理 低温低渗的CaCl2处理细菌可使之能够摄取外源DNA，成为“感受态”。 Ca2+可与DNA形成复合物，可对抗DNase，并附着于细菌表面。 热休克促进复合物进入细菌。 注意事项： 无菌 低温 动作轻柔 设对照 操作步骤——感受态的制备 将细菌培养物30ml离心，3000 rpm 10 min 弃上清 加入10～20ml预冷的CaCl2,悬浮好，尽快吹打几次。 离心，1500rpm，5min(离心速度要低，时间不能太长） 弃上清 加入1 ml预冷的CaCl2，搅起，但不能吹打。 冰浴30min，可在16h内使用或保种。 操作步骤——转化 将感受态细胞分别加100μl 到4个EP管中 1号只有感受态细胞（阴性对照 2号为感受态细胞＋连接混合物5μl（样品管） 3号为感受态细胞＋质粒1μl（阳性对照） 2. 冰浴30min 3. 42℃热休克90～120sec（温度要准确） 4. 每管加入无抗生素的LB (37℃预温为好）培养基37℃温育30~60min（若在摇床上，则摇速一定要低） * * * 将重组DNA分子导入受体细菌中进行复制扩增，再进行检测，以获得正确的阳性重组体。将重组DNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。一般受体细菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。后来人们发现，用氯化钙处理后的细菌细胞对DNA的摄取能力大为增加，转化效率提高。这种细菌细胞能摄取外来DNA的生理状态称为感受态，此阶段的细菌称感受态细菌。