染色体外同源重组与细胞质注射技术研制转基因动物研究.pdfVIP

摘要 摘 要 转基因动物技术与动物体细胞克隆技术的结合，开创了生物高新技术的新 领域。转基因动物作为一种生物反应器，尤其是乳腺生物反应器，仍为高新技 术领域的研究热点。其中研究的焦点集中在基因定位整合 (打靶)、转基因途 径的有效性、转基因动物的遗传稳定性及扩群。本文侧重于转基因途径的有效 性，对转基因方式和基因定位整合 (打靶〕的新策略进行了探索。目前制作转 基因动物的途径主要有五种，分别为 1.显微注射法;2.通过病毒载体感染胚 细胞;3.ES细胞介导的方法:4精子载体法:5.体细胞核移植。显微注射法 是其中常用的一种方法，一般的显微注射是将基因直接注射入受精卵的原核， 这种方法的缺点不仅技术要求较高、对受精卵细胞损伤较大、成活率低，而且 基因多以首尾相连的多拷贝形式随机整合。Page等人对通过显微注射受精卵 原核产生转基因动物的方法进行了改进，他们用人工合成的聚赖氨酸和DNA 构件形成复合体进行注射细胞质来产生转基因动物获得了成功。这样可以降低 操作对受精卵的损伤，提高成活率。染色体外同源重组是一种基因构建策略的 改进，Frank等人在1992年将hSA基因分为三段，片段之间相互重叠I.85k6和 2.5kb。三片段以等摩尔数经显微注射入鼠受精卵原核中，获得的三个片段同 源重组的几率占转基因鼠的74 ，目前对这一方面的研究应用并不多。本研 究内容和目的是:1)构建可用于0-绵羊乳球蛋白(5-LG)基因打靶的转基 因表达载体 (为本室承担的科研任务的一部分);2)通过转基因小鼠的制备 和检测，验证上述转基因载体的有效性;3)探索更加完善的显微注射转基因 技术，包括卵细胞质注射、核定位蛋白的使用以及染色体外重组。 为了验证染色体外同源重组技术结合细胞质注射技术制备转基因动物的 可行性，本实验通过细胞质共注射将部分重叠的两段转基因载体片段注射到小 鼠受精卵细胞质中 同时利用核定位序列 (NLS)的定向迁移功能，将转基因 载体片段带入核区 制备有功能的转基因小鼠。实验结果证明这种方法是有效 的，这为以后利用构建的基因打靶载体来制备转基因的绵羊成纤维细胞，进而 染色体外同源重组与细胞质注射技术研制转基因动物 利用核移植方法制备转基因绵羊奠定了基础。 本研究以绵羊Ja乳球蛋白基因组 p‘-LG)为转基因表达框架，将人G-CSF 基因与报告基因一绿色荧光蛋白(EGFP)基因拼接到S-LG基因的第一外显子 处，在G-CSF基因两侧引入同源重组位点loxP,Iox2272。并将打靶基因表达 构件0-LG-hG-CSF一工RES-EGFP(总长:9.3kb)分为两段进行构建，片段工(长: 5.9kb)与片段ii(长:5.6kb〕两段重叠部分为2.2kb。向小鼠受精卵细 胞质共注射片段工、ii和NLS三个片段。对仔鼠进行整合与表达的检测。经 PCR-Southern杂交检测，片段I的整合率为62.3% (86八38)，片段I工的整 合率为54.3% (75/138)，片段1.II都有整合(包括两片段分别整合和染色 体外同源重组两种情况)的小鼠为62只，占出生小鼠44.9% (62/138)，其中 在转基因小鼠中发生染色体外同源重组的几率为 80.6% (5侧62)。经 RT-PCR-Southern检测，以片段I发生整合的转基因小鼠为统计基数，人G-CSF 基因的表达率84.z% (16/19)。EGFP基因的表达率为73.6% (14八9)。将 小鼠乳汁用波长扫描检测，证得EGFP基因的表达率为47.3% (9/19)。以发 生染色体外同源重组的转基因小鼠为统计基数，人G-CSF基因的表达率9093 (9/10)，EGFP基因的表达率为100% (10/10)。将小鼠乳汁用波长扫描检 测，证得EGFP基因的表达率为50% (5/lo)。上述结果表明，染色体外同源 重组结合细胞质注射技术研制转基因动物是可行的，且效率高，方法简单、实 用，便于推广。 关键词染色体外同源重组 核定位蛋白转基因小鼠p一乳球蛋白基因EGFP 人粒细胞集落刺激因子 摘要 Abstract TransgenicAnimalsProducedbyExchromosomalHomologous