血红蛋白的提取和分离].ppt

凝胶色谱操作 ——纯化 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 教材图5－19 3.样品的加入和洗脱 材料:交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填: 凝胶色谱柱的装填： 步骤 操作要求 ① ② ③ ④ ⑤ 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 洗涤平衡 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 装填悬浮液 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 凝胶色谱柱的装填： 该步骤的关键： 2、装填凝胶柱时不得气泡存在： 1、凝胶装填时尽量紧密 否则，色谱柱内形成无效空隙，使本该进入胶体内部 的样品分子从空隙中通过，搅乱洗脱液的顺序，影响 分离效果 气泡会阻挡大分子蛋白质通过空隙，小分子 无法进入下一胶体内，搅乱洗脱液的顺序， 影响分离效果 挽救措施：轻敲柱体以消除气泡 凝胶色谱柱的装填： 如何判断装填是否成功？ 2、加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。 如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的 性能良好。 1、凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱 旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是 否装填得均匀 装配好的凝胶柱 凝胶色谱柱 样品的加入和洗脱： 缓冲液 讨论： 答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持正常结构和功能 注意：正确的加样操作 1、不要触及破坏凝胶面 2、贴壁加样 3、使吸管管口沿管壁环绕移动 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 阅读教材64页“凝胶色谱法”相关内容，思考： 1、凝胶是什么？ 2、该方法依据的原理是什么？ 凝胶色谱法原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 凝胶色谱法分离蛋白质原理 凝胶色谱法分离蛋白质过程 试管中先收集得到 大分子蛋白质，后收 集得到小分子蛋白质 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 B 如何使蛋白质离开人体后保持 性质不变呢？ 给予其与细胞内相似的环境，如pH 1、定义： 2、作用： 3、缓冲溶液类型： 在一定范围内，能够抵制外界酸和碱对溶液pH值的影响的溶液 维持PH基本不变 弱酸及其所对应的盐 多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐 弱碱及其所对应的盐 见《点金》65页 缓冲作用：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生变化的作用 4、组成： 通常由1—2种缓冲剂溶解于水中配置而成 调节缓冲溶液的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液 6、作用： 模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性） 5、本实验所用缓冲溶液 20mmol/L的磷酸缓冲液（PH=7） 阅读教材65页“电泳”相关内容，思考： 1、该方法依据的原理是什么？ 2、SDS的作用是什么？ 2、原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和迁移速度不同。 1、概念： 带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 ? 决定 运动方向 电场 作用力 形成 阻力 决定 运动速率 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 √ √ √ √ √ √ √ 3、类型： 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率取决于它所带电荷的多少以及分子的大小等因素 测定（ ）通常用 SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量 4、SDS的作用： 使蛋白质解聚成单链，掩盖不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 SDS电泳动画 血液 血浆 水 分 其他物质： 血浆蛋