棉铃虫抗真菌肽拟靶基因与果蝇drol新基因研讨.pdfVIP

摘要 根据果蝇中发现的抗真菌肤Drosomycin因子在GenBank中的6个 登录序列，按其同源区段的氨基酸序列设计简并引物Drsl和Drs2，以 生活在潮湿腐生环境中的9种拟靶昆虫为研究对象，通过PCR方法，希 望在基因组水平上搜查新的昆虫抗真菌肤拟靶基因序列。根据简并引物 特点，采用单、双引物进行 PCR扩增筛查，将美洲棉铃虫 (Heliothis armigera)双引物PCR扩增产物h〔a)克隆到pGEM-T载体上，转化E.coli DH5a。在含有工PTG,X-Gal和Amp的LB平板上，利用蓝白斑筛选含有 外源插入片段ha的重组质粒pGEM-T-ha，对酶切和PCR双重鉴定后的重 组质粒中的ha片段测序，获得了1条299bp的核营酸序列，应用网上资 源和生物信息学软件，对该序列进行生物信息学分析，发现该序列中 1 段99bp编码33个氨基酸残基的序列，推测可能是美洲棉铃虫抗真菌肤 拟靶基因的部分序列。对首次发现的该ha片段初步定名为Helioarmicin A,GenBank登录号为AY223516。同时，由ORFfnider软件在ha片段 的互补链上，搜索到1个开放读码框，编码33个氨基酸，因其功能无法 推测，暂定名为HelioarmicinB,GenBank登录号为AY221108a 由果蝇抗真菌肤Drosomycin的cDNA序列 (不含信号肤)设计特异引 物Dro3和Dro4，以果蝇基因组DNA为模板，PCR扩增获得了不含信号肤的 Drosomycin基因dro片段，将该片段回收分别插入到pGEM-3zf,pHIL-S1 和pET-21d载体中，转化大肠杆菌受体细胞。在含有工PTG,X-Gal和Amp 的 LB平板上，利用蓝白斑筛选含有外源插入片段的重组质粒 pGEM-3zf-dro、pH工L-S1-dz℃和pET-2ld-dro。通过酶切和PCR双重鉴定 后，将重组质粒 pH工L-Sl-dro和 pET-21d-dro测序，发现在重组质粒 pHIL-Sl-dro中插入的长 135bp的dro片段与文献报道的果蝇抗真菌肤 DrosomycincDNA相应区段的序列完全相同;而在重组质粒pET-21d-dro 中插入的长135bp的dro片段与果蝇抗真菌肤DrosomycincDNA相应区段 的序列相差较大，只有79%的同源性。将pET-21d-dro中的d1(，片段与果 蝇基因组全序列做BLAST相似性比对，发现在果蝇基因组中含有与之相似 的序列 (非Drosomycin基因位置)，相似性达98 ，仅有两个碱基不同， 因此推测该序列可能是1个新的果蝇抗真菌肤拟靶基因序列，命名为droll 己登录GenBank，登录号为AY225091。由drol推导的编码序列含有44个 氨基酸残基，与果蝇抗真菌肤 Drosomycin有 72%的同源性，并且与 Drosomycin活性位点、保守区段的氨基酸残基完全相同，因此推测，它可 能是果蝇抗真菌肤Drosomycin家族的又一新成员，定名为Drosomycin-like C(Drol)。该氨基酸序列己登录GenBank，序号为AA0672410 运用生物信息学软件对Drosomycin-likeC的二级结构和理化性质进行 分析，得到如下推断:Drosomycin-likeC是一种具有CSap模体结构的蛋 白质，即8个Cys形成了4个分子内二硫键桥，包含有a-螺旋、p一折叠和 环结构，a-螺旋和p一折叠交替排列。它的形状呈非球形，有20.4%的残基 超〔过16Yo)暴露于溶剂，它的平均分子量为4962.70Da，等电点 (p工) 为8.74. 经由本文研究采用简并引物和特异引物的PCR扩增方法，首次在美 洲棉铃虫和黑腹果蝇中分别克隆到了新的昆虫抗真菌肤拟靶基因序列ha 片段和果蝇抗真菌肚新基因drol序列。同时在ha片段的互补链上发现 1个完整的ORF序列。相信对ha片段、drol序列的克隆和今后对其功能 的证实，将对昆虫抗真菌肤的基础理论研究、生物制药开发和转基因抗 病育种研究有重要的意义。 关键词:昆虫抗真菌肚 美洲棉铃虫 (Heliothisarmigera) 黑腹果蝇 (DrosophilamelanogasterMeigen) 克隆 序列分析 1.前言 昆虫抗菌肤 (Antibacterialpeptide)是生物体免疫诱导产生的一种具 有生物活性的小分子多肤，分子量在2000-70