杂色鲍血蓝蛋白的分离纯化及其理化性质的研讨.pdfVIP

杂色鲍血 导师姓名 职称： 丁雪娟教授王江勇研究员 专 业： 水产养殖 院 系： 生命科学学院 答辩时间： 2010年5月25日 Submitted 0 5，201 Date：May 摘要 杂色鲍血蓝蛋白的分离纯化及其理化性质的研究 专业名称：水产养殖 申请者姓名：彭文 导师姓名：丁雪娟王江勇 摘要 氧气的大分子铜蛋白，它直接溶于血淋巴中，随着血淋巴的循环为身体各组 织提供氧气。Hes在结合氧的条件下为蓝色，脱氧时为无色。虽然Hc跟酚 氧化酶在体内的功能不同，但是它们都属于type．3型蛋白，近年来发现，节 肢动物和软体动物的Hes也能表现出酚氧化酶活性；一些物种的Hes还存在细胞 和细菌凝集活性，部分Hcs及其降解肽段还具有抗菌、抗病毒的功能。软体动物 Hcs是自然界最大的呼吸蛋白，研究表明它除了具有储存和运输氧气的功能 以外，在生物进化、寄生虫检测以及抗肿瘤等研究领域也得到应用。国内 对于节肢动物血蓝蛋白的研究较多，而对软体动物血蓝蛋白的研究甚少。 本文以杂色鲍为材料，利用超速离心和CsCI梯度离心的方法，从杂色鲍 血淋巴中分离纯化Hcs，SDS．PAGE检测提取的Hcs由一种亚基构成，分子量约 1和HdH2； 透射电镜下其四级结构为圆柱体，以多十聚体、二十聚体和少量的十聚体存在血 淋巴中。紫外吸收光谱法测定杂色鲍Hcs在280nm和340nm处存在吸收峰值。 杂色鲍Hc在以邻苯二酚为底物的条件下表现出微弱的酚氧化酶活性(肥5．66 mmol／L)，一定浓度的胰蛋白酶、SDS和尿素都能使其酚氧化酶活性获得不同程 度的增强；以左旋多巴(L．DOPA)为底物则不表现出酚氧化酶活性，说明杂色 鲍Hes发挥HdPO酶活性很有可能是一种儿茶酚酶类型的酚氧化酶(PO)。以邻 苯二酚为特异性底物研究杂色鲍Hc的酚氧化酶活性，研究表明，血蓝蛋白酚氧 6．4；铜离子(Cu2+)能极其显著增强血蓝蛋 化酶活性最适温度34℃、最适pH 白的酚氧化酶活性，增强率为264％，而乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、镁离子 ．1． 华南师范大学硕I：学俯论文 对He酚氧化酶活性影响不显著。 半定量RT-PCR结果显示，腹足和外套膜是血蓝蛋白在杂色鲍体内合成 的主要部位。以哈维氏弧菌感染正常杂色鲍，检测lh、3h、6h、12h、24h血蓝 蛋白基因在腹足和外套膜上表达的变化情况，发现腹足和外套血蓝蛋白基因的表 达在感染哈维氏弧菌后先微弱升高，后显著降低，推测其可能跟免疫相关。 对杂色鲍Hcs理化性质的研究，加深了对Hcs在软体动物非特异性免疫 系统中作用的认识，具有一定的科学意义，为贝类健康养殖提供了参考依据。 关键词：杂色鲍 血蓝蛋白 分离纯化 理化性质 WANG Supervisor：DINGXue-juan Jiang-yoI瞎 ABSTRACT with molecularmasswhichserveas Hemocyanins(Hcs)arecopperproteinshigh carriersinthe ofseveral and areshown