第3章 蛋白质研究技术.ppt

第二章 蛋白质研究技术;第一节 蛋白质的分离与纯化;一、蛋白质分离纯化的基本原则;二、蛋白质分离纯化的方法;① 离心（centrifugation）; 离心（centrifugation）;Ⅰ.差速离心（differential centrifugation）;差速离心（differential centrifugation）;Ⅱ. 速率区带离心（rate-  zonal centrifugation）; ;② 电泳（electrophoresis） ;Ⅰ.SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS） Ⅱ.等电聚焦（isoelectric focusing ，IEF ） Ⅲ.双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis） Ⅳ.脉冲电泳（pulsed-field gel electrophoresis） ;Ⅰ. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）;SDS ;SDS ;Ⅱ. 等电聚焦（isoelectric focusing ，IEF ）;不连续电泳的三种效应： 浓缩效应， 分子筛效应 电荷效应 ;Ⅲ. 双向电泳（two-dimensional  gel electrophoresis）;双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）;双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）;Ⅳ. 脉冲电泳（pulsed-field gel electrophoresis）;③ 层析（chromatography）;层析（chromatography）;Ⅰ. 凝胶过滤层析（gel filtration  chromatography ） ;凝胶过滤层析; 凝胶上柱后，颗粒外的外水体积（Vo），颗粒内体积称内水体积（Vi），颗粒中胶的体积（Vg），因而，总的柱床体积（Vt），Vt=Vo+Vi+Vg，Vg可忽略。Vt=Vo+Vi 。;①当kd=0时，Ve=Vo，溶质全从Vo 出来，无分配。 ②当kd=1时，Ve=Vo+Vi，溶质全 进筛子，各物质尽管有分配，但 各物质不能分开。 ③当0kd1时, Ve=Vo+kd·Vi各溶 质具不同分配，以得到分离。;Ⅱ. 离子交换层析（ion-exchange chromatography）;离子交换层析（ion-exchange chromatography）;Ⅲ.亲和层析（affinity chromatography）;亲和层析（affinity chromatography）;膜蛋白的分离;几种去污剂;?低浓度时，去污剂以游离形式存在于溶液中。随着浓度的增加，它们聚合在一起，形成微团（micelles）. ?微团很小、圆球状聚集物。其亲水部分向外，疏水部分向内。 临界微团浓度（critical micelle concentration，CMC）：去污剂开始形成微团时的浓度，为去污剂的特征常数;?离子型去污剂除了能与膜蛋白的疏水区结合外，还能结合水溶性蛋白质的疏水核心。由于它们带电，所以能够破坏蛋白质中的盐键和氢键, 使蛋白质变性。 ?非离子型去污剂在不同的浓度有不同的作用方式 ?浓度较高（ CMC）时，与磷脂、膜蛋白一起形成微团. ?浓度较低（CMC）时，虽然不形成微团，但仍能与大部 分膜蛋白的疏水区结合，起增溶作用.;?大部分膜周边蛋白（peripheral protein）通过离子键或其他弱键与特定的膜蛋白结合，因此可用高浓度的盐或能与二价阳离子（如 Ca2+）结合的试剂进行分离。 ?大多数膜周边蛋白是可溶性的，不能用非离子型去污剂增溶。;第二节 蛋白质的鉴定;一、分子量测定;Ⅰ. 渗透压（osmotic pressure）;Ⅱ. 沉降平衡（sedimentation  equilibrium）;Ⅲ. 凝胶过滤层析（gel fitration chromatography）;Ⅳ. SDS;Ⅴ. 激光解吸电离飞行时间质谱（laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry ,LDI-TOF-MS ）;激光解吸电离飞行时间质谱;二、等电点测定; 三、末端氨基酸残基测定;　N-terminus 氨基酸残基测定;C-terminus 氨基酸残基测定;四、蛋白质分子中的糖链;五、蛋白质分子中