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第二节 诱变育种的步骤与方法 一、出发菌株 二、出发菌株的纯化 三、单孢子或单细胞悬液的制备 四、诱变剂和诱变剂量 五、诱变剂的处理方式 六、影响突变率的因素 一、出发菌株：用于每代诱变的实验菌株 是决定诱变效果的重要环节 （一）对一般出发菌株的要求 野生型菌株 生产中自然选育的菌株 具有有利性状的菌株 已发生某种变异的菌株 增变菌株 选择出发菌株应注意的问题？ （二）选择具有一定生产能力 或某种特性菌株作出发菌株 （1）能够合成目的产物 （2） 最好：生产使用的优良菌株 选择出发菌株应注意的问题？ （三）选择纯种作出发菌株 why? 纯种是决定诱变效果的关键 How? 选择 单倍体细胞 单核细胞 少核细胞 （四）应考虑出发菌株的稳定性 避免使用对诱变剂不敏感的高产菌株 （1）高产菌株一定是 继续提高产量 潜力最大的菌株吗？ （2） 选择遗传性状不太稳定的菌株， 还是稳定的？ （五）连续诱变育种过程中如何选择出发菌株 突变株产量是数量遗传 一次大幅度提高发酵水平几乎不可能 挑选每代诱变处理后 均有一些表型上改变的菌株 why？表型改变 遗传稳定性 对诱变剂敏感性提高 （五）连续诱变育种过程中如何选择出发菌株？ 增变菌株：自发突变率高，增变基因控制 该基因突变后，DNA上其他基因易突变， 导致细胞和生物体各种特性易自发突变 （六）选择出发菌株的其他因素 产孢子多 不产或少产色素 生长速度快 糖氮利用快 黏度小 耐消泡 （七）采用多出发菌株 p97 一般选择3~4个出发菌株 一个菌株长期诱变后， 性状改变不明显，how？ 二、出发菌株的纯化 目的：获得遗传性状基本一致的，稳定的变种 方法：划线分离法、稀释分离法、 显微操作装置分离 经验：分离孢子时，延长培养时间， 使孢子趋于老年 遗传性状充分分化并稳定 三、单孢子或单细胞悬液的制备 原因：分散状态的细胞可均匀接触诱变剂 避免长出不纯菌落 三、单孢子或单细胞悬液的制备 制备菌悬液时，有什么要求吗？ 1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮 稀释用水：物理诱变时，常用生理盐水 化学诱变时，用相应缓冲液 2、菌悬液制备方法 p98 细菌：摇瓶液体振荡预培养，对数期，同步培养 产孢子菌类：成熟而新鲜孢子，液体振荡培养至孢子刚萌发 芽长为孢子直径的0.5~1倍 不产孢子的真菌：年幼的菌丝体 方法3种：菌丝尖端法、处理单菌落周围尖端菌丝、 混合处理法 3、制备原生质体作诱变材料 优点： 丝状真菌，菌丝有分化，去壁后原生质体是异质的， 增加了突变的可能 微生物原生质体无细胞壁，对诱变剂更加敏感 不产孢子的丝状真菌，可能增强诱变效应 四、诱变剂及诱变剂量 （一）诱变剂种类的选择 １、选择诱变剂 ２、根据菌种特性和遗传稳定性选择诱变剂 ３、参考出发菌株原有的诱变谱系选择诱变剂 （二）最适诱变剂量的选择 四、诱变剂及诱变剂量——（一）诱变剂种类的选择 一种诱变剂对不同菌株诱变效应不同 不同诱变剂对同一菌株诱变效应不同 无法用某一诱变剂定向改变某一性状 四、诱变剂及诱变剂量 ——（一）诱变剂种类的选择 1、选择诱变剂 注意：诱变剂主要对 DNA分子上基因的某一位点发生作用 紫外线 亚硝酸 5-溴尿嘧啶 四、诱变剂及诱变剂量——（一）诱变剂种类的选择 2、根据菌种特性和遗传稳定性选择诱变剂 遗传稳定的出发菌株： 强诱变剂 温和诱变剂 遗传不稳定的出发菌株： 自然分离 挑选某一类型菌落为出发菌株 温和诱变剂 四、诱变剂及诱变剂量—（一）诱变剂种类的选择 3、参考出发菌株原有的诱变谱系选择诱变剂 有的菌株对某一种或某一组合诱变因子敏感 诱变史长的高产菌株，长期多次使用某一诱变因子 可能出现对该诱变剂的钝化反应，即饱和现象 因此，可通过预试验， 采取生产能力分类法选择诱变剂 生产能力分类法 （二）最适诱变剂量的选择 p101 原则：使目的突变株在存活群体中占有最大比例 （二）最适诱变剂量的选择 （2）采用形态变异率做指标 正突变和形态突变的最适剂量往往不一致 正突变的最适剂量为最高形态变异剂量的1/3 四、诱变剂及诱变剂量——（二）最适诱变剂量的选择 （３）判断诱变