利用3氨基5羟基苯甲酸AHBA合酶基因保守序列发现潜在的生物合成基因簇研究.pdfVIP

利用 3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合酶基因保守序列发现 潜在的生物合成基因簇 王以光*高群杰 韩锋 杜煜 尚广东 中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所 北京天坛100050 *通讯作者 关键词 AHBA安莎类抗生素 基因保守序列 微生物来源的产物如抗生素在人类与疾病的斗争中发挥了巨大的作用 以活性为指标是目前大多 数常用的筛选微生物药物的方法 其缺点是从活性筛选出发 无法显示化学结构的特点 从活性筛选到 化学结构的确定 需要经过发酵 提取分离 纯化及结构鉴定的繁杂过程 而且 对未知性质的物质确 定提取及纯化方法 需要探索及经验积累,工作量大 收效有限 在大量微生物产物被发现及应用的基础上 可以看出某些结构类型的化合物 如青霉素 头孢菌素 等 b-内酰胺类化合物具有广谱抗菌活性强 毒性低的特点 安莎类化合物的活性类型多 包括抗菌 抗分枝杆菌 抗麻疯 抗肿瘤 免疫抑制 抗虫等 最近又发现其具有广谱抗病毒作用 因此 建立以 [1] 鉴别化学结构为主的筛选方法 可以比较有针对性地筛选目的结构化合物 Hans Zahner曾提出用与 化学结构某些基团如还原糖 胺基酮酸等分子基团或生物硷 含氮 含卤素等起反应的试剂 建立筛选 方法 他使用四氮唑兰筛选产生了缩酮类 ketalin化合物 但这种方法不能使用发酵液直接进行筛 选 仍需经过初步提取 并在TLC薄层板上进行纯化 难以适用于高通量筛选 微生物产物尤其是次级代谢产物抗生素分子生物学研究的进展表明 结构类型相似的抗生素其生物 合成编码基因有共同性 某些基因序列有高度保守性,因此,利用生物合成基因保守序列,克隆获得已知 相似结构的生物合成基因,已广泛地得到了应用[2,3 ] 安莎霉素Ansamycin是由多种微生物及植物产生的一类结构独特的天然化合物 它属于一种大环内 酰胺,它们的结构特点是都含有一个芳香环的发色团 芳香环的脂肪族安莎链通过酰胺键与之连接形成 大环结构 Ansamycin类的发色团由一个苯或萘的六元碳环组成 Ansamycin生物合成途径研究显示[4 5] ,安莎霉素结构中安莎链是通过丙二酸盐和乙酸盐为单位通过缩合作用合成的,而且每个延长单位保持 适当的还原水平,这提示脂肪族链的装配合成是在多功能的 型聚酮合酶 PKS催化下 通过聚酮体合 成途径完成的 而聚酮体的聚集装配起始于mCN单位 发色团起始于mCN单位 mCN单位衍生于3- 7 7 7 氨基5-羟基苯甲酸(AHBA) 根据AHBA衍生的芳香环结构的不同 可以将安莎类抗生素分为萘醌型安莎类抗生素和苯醌型安莎 类抗生素 苯醌型安莎类抗生素包括 geldanamycinansatrieninAansamitocin等[3,6,7]而 NapthomycinrifamycinB代表萘醌型安莎类抗生素[8,9] [10] AHBA的合成可能衍生于莽草酸生物合成途径 ,有 3-脱氧 -D-阿拉伯 -庚酮糖酸 7磷酸(DAHP) 合酶 脱氢奎尼酸合酶 脱氢奎尼酸脱水酶 AHBA合酶等参与 磷酸化酶 氧化酶及激酶也参与AHBA 的合成过程 本研究应用AHBA基因保守序列在克隆苯醌类安莎霉素-格尔德霉素 geldanamycin生物合成基因 1 时 从该产生菌 Streptomyces hygroscopicus 17997中 发现了另一个与萘醌类抗生素生物合成基 因相似的基因簇;用根据保守序列所设计引物,对20株未定结构的具抗病毒活性抗生素产生菌基因组进 行PCR检测,发现3个与安莎类化合物合成相关AHBA基因,推测为安莎类抗生素产生菌 材料和方法 1.1菌株和质粒 链霉菌 S.hygroscopicus 17997格尔德霉素产生菌 及其它抗生素产生菌 均未本所保藏 大肠 [11] 杆菌DH5 [supE44lacU169 (80lacZ thi- 大