北京鸭成纤维细胞库的构建及生物学研讨.pdf

北京鸭成纤维细胞库的构建及生物学研究 关伟军1，马月辉1， 梁海青2，候水生1，于太永3，张海艳4 (I中国农业科学院畜牧研究所北京10094：2山西农业大学动物科技学院山西太谷030801，3西北农林科技大 学动物科技学院陕西杨凌712100：4洛阳师范学院生命科学系河南洛阳471022) [摘要】 以12日龄北京鸭鸭胚为研究材料，采用组织块直接培养法成功地构建了样本含量为66 的成纤维细胞库．生物学分析结果表明：细胞群体倍增时间(PDT)约为24小时；50个核型中二倍 细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性；转染率高，能很好地表达外源基因．该细胞库的各项指标 均达到ATCC细胞系鉴定标准．此项研究不仅在细胞水平上保存了北京鸭这一重要畜禽品种的种质资 源，而且亦为其基因组和后基因组及体细胞克隆等研究提供宝贵试验材料．同时，此技术平台的建 立必将为其它畜禽遗传资源细胞水平的保存提供技术与理论支撑和保障． [关键词】 北京鸭；成纤维细胞库；资源保存；生物学研究 21世纪，全球自然资源的可持续利用在一定程度上依赖于生物资源的适应性，而生物资源的适 应性又由生物多样性所决定，因此，研究生物资源、维护生物多样性成为人类和各国政府共同关注 的焦点。畜禽遗传资源多样性是生物多样性的重要组成部分，是人类社会赖以生存和发展的基础。 1993年，FAO着手制定《全球家养动物遗传资源管理战略(全球战略)》，在1995年的第二届会议 上，缔约国通过决议，承认农业生物多样性的特殊性，鼓励缔约方编制目录，审议家畜资源状况及 保护和可持续利用的措施。继之，许多国家也相继制定和实施了家养动物遗传资源管理计划和保护 措施。 活体保种、冷冻精液和胚胎是我国目前采取的主要保种措施，但是，前者需投入大量人力、7物 力和财力，后者的适用范围又十分有限，因此，仅靠以上技术措施很难对我国畜禽品种进行有效保 护。近年来随着生物技术特别是细胞工程、体细胞克隆等的发展使在细胞水平保存动物种质资源成 为可能。 本实验从培养和冻存北京鸭二倍体稳定细胞——成纤维细胞入手，并依照美国典型培养物中心 (ATCC)要求的细胞库质量控制方法，对建成的细胞库进行检测，以期对这一品种的遗传资源从细 胞水平上长期保存下来。 1材料与方法 1．1培养基及主要试剂 作者简介：关伟军，男，1966年生，博士后，教授、博导：研究方向：分子生物学。 基金项目：国家自然科学基金、基础性工作重大专项(200IDEAl0006)资助。 Hoehst 33258，Trypan Detection blue(Sigma)，MycoplasmaKit(Roche) 1．2原代培养 在超净工作台内，敲破胚蛋大端用眼科镊小心取出胚胎，置于小培养皿内。用PBS洗3-4次， 除去胚胎的眼、四肢、内脏及体表绒毛。在另一无菌的培养皿中，用眼科剪将其剪成lmm3大小的组 织块。当操作时间过长，组织发干时可滴入适当PBS或全培养基。用眼科剪将组织块移至培养瓶底 壁，用巴氏管分散均匀，盖好瓶盖，贴标签作好记录后，倒置放入培养箱(37C、5％C02、饱和湿度) 中。2’3小时后取出，加入全培养基，倒置放回。7’8小时后翻瓶，使培养基浸没组织块，放回继续 培养。一般原代培养期间可以不换培养液。当生长不理想时，视培养基颜色(变黄时)，进行换液。 1．3传代培养 当细胞铺至瓶壁的80％’85％时即可传代，进行传代培养。倒掉培养基，加入生理盐水清洗2’3 次，倒净生理盐水。加入0．25％的胰蛋白酶O．15’O．25mi，加入的胰酶暂时不要和细胞接触，放入培 养箱中预温5’7分钟，翻瓶，使胰酶均匀淌过细胞表面，放入培养箱作用30秒，显微镜下即可看到 细胞回缩，细胞间隙增大，细胞由纤维状变为球状，消化下的细胞飘雪花似地脱落下来(Freshney， 2000)。此时马上加入全培养基立刻终止胰酶作用。按1：2或1：3的比例分瓶，放入培养箱中继 续培养。 1．4冻存 传至～定代数，细胞数量达到需要时即可准备冻存。冻存前24h更换培养液。常规法消化细胞， 加培养液终止反应。应用红细胞计数板计算冻存细胞总数，1000rpm离心8min，收集细胞。小心吸 除上层的培养液。根据细胞计数的结果和冻存的数量要求(3．5-5．O×106个细胞／m1)加入相应冻存 液。用吸管轻轻吹打均匀，转入冻存管。严密封口，标明日期、品种、细胞名称、培养代数。将冻 存