提取RNA及PCR步骤.doc

一、提取组织RNA 1．准备好冰盒、1.5mlEP管(无RNA酶)、剪刀及镊子（需消毒，再用灭菌纯水和DEPC水洗净）、钻头、灭菌纯水等。 2. 取出冻存管，剪取约0.5cm放于EP管。 3. 即刻加1ml trizol，剪碎至无可见微粒，静置5-10min 4. 加0.2ml 氯仿，盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s, 15-30℃静置2-3min 5. 离心12,000g*15min, 2-8℃ 6. EP管内分三层，取上层液相置于新EP管 7. 加0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，15-30℃静置10min 8. 离心12,000g*10mim, 2-8℃ 9. 弃上清（不用吸净残液），加1ml 75%乙醇清洗沉淀(乙醇用前需4℃预冷) 10. 离心10000/7500g*5min, 2-8℃ 11. 去上清（需吸净残液），干燥RNA(超净台内风干至白色变透明状，约1h以上), 加10—12ul DEPC水解（约1h以上），测浓度，-80℃保存。 PS：1.所用枪头、EP管、DEPC水、纯水、剪刀、镊子均需灭菌。 2.75%无水乙醇用前需4℃预冷。 3．若最后提取出的RNA量多，可加30ulDEPC水溶解;若难以溶解，可置于55℃水浴加热。 4．破碎：取组织勿过多，否则难以破碎，亦难以提取RNA；一个样品破碎过后需清洗，顺序为：酒精棉球擦洗→DEPC水洗→拆分清理→纯水洗→棉球吸去钻头残液。 5. 破碎仪的使用：打开前先保证已调于低档，将钻头浸没于样品中，切忌在空气中空转，从低到高慢调，同时上下轻移样品，注意力度控制，避免液体飞溅误伤；同时注意听破碎时的声音，若有尖锐声音发出，说明有异物卡住钻头，需停止查看。二、提取细胞RNA 1. 细胞加1ml trizol 裂解5min, 15-30℃ 2. 加0.2ml 氯仿，盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s, 15-30℃静置2-3min 其余步骤参见提取组织RNA的第5步开始 PS：1. 新EP管需用无RNA酶EP管。 2. 操作过程需时刻注意避免污染，EP管取放时勿碰到内壁及管口，每步操作前需适时擦拭双手及枪管。 3．RNA勿照紫外。 4．DEPC水量较关键，需保证RNA充分均匀融解，若可用肉眼看到白点，可多加至20ul。三、测RNA浓度： 准备96孔板→开盖，盖子朝天放→加98ulEDPC→预读（setting：OD值 260；选中区域；选“预读”） →“Read” →结果复制→拿出孔板，再加2ulRNA→直接“READ” →复制结果（复制后的结果与软件上的不同，此为已经相减后的数据）→重设条件（setting：OD值 260 280；选中区域；“Normal”；“Delete”；“OK”） →“READ” →复制结果→数据处理： CRNA(ug/ml)=“Normal”值—预读值 CRNA(ug/ul)=50(稀释倍数)*40（OD值）*1/1000* CRNA(ug/ml)=2* CRNA(ug/ml) VRNA=1ug（可变）/ CRNA VH2O=V（总体积由说明书得）—VRNA PS：1.C260/ C280的比值意义范围为1.8—2.0,小于1.8可能是蛋白含量较多，大于2.0可能是DNA含量较多 2．往孔板加液时，勿使枪头顶端碰触孔板内壁，以防损伤内壁包被液 3. 样品多的话，不用分别加入，可先配总量，再分装 四．反转录PCR 1．加：1ul oligo(dT) 1ng—5ug 总RNA 1ul 10mMdNTP混合物 灭菌水（DEPC） 加至11ul（12-1） 2．混合物：放入PCR仪→65℃， 5min→结束后迅速移至冰上 3．加：4ul 5*buffer 2ul 0.1M DTT 轻混匀→PCR→37℃， 2min 4. 室温下加入1ul M-MLV→轻混匀（防气泡） 5．PCR仪：37℃，50min + 70℃,15min + 4℃, 5min PS:1.冰上操作，严格遵守无RNA酶操作 2．加液时，枪头贴近液面快速打出液体，提离液面后放松五．Q-PCR1. 加液：SYBR 5ul （ ROX 0.2ul（eppendorf AG PCR无需加此物）） Primer 0.2﹢0.ul cDNA 0.5ul H2O 4.1ul 离心： A、8联管：样品对称离心→打开离心机总开关→打开盖子→对称放入样品→盖面上的白点对准机孔边的标签盖好→按“启动” →转速升到“1100”左右→按“停止” →等转速降至“60”左右开盖取出→仪器复位 B、96孔板：水平离心，3000rpm,3-5min PS：加液或转运样品时均需用到冰盒。 3. 实时荧光定量PCR的使用（eppendorf AG PCR）： A．仪器结