生物化学 第二章 核酸的结构与功能 （1）核酸的种类和组成单位（2）核酸的分子结构（3）核酸的理化性质.ppt

碱基、核苷、核苷酸的概念和关系  3.1 证明DNA是遗传物质 1. 1944年O.T. Avery等，肺炎双球菌转化实验 2. 1952年A.D.Hershey等，噬菌体感染实验 真核生物染色体DNA组装不同层次的结构 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * L为连接数，是指环形DNA分子两条链间交叉的次数，只要不发生断裂，L是常数。T为双螺旋的盘绕数，W是超螺旋数，他们是变量 * * * * * * * * * 5′ 3′ 3.2 核酸的紫外吸收性质 核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基中含有共轭双键体系，因而具有特殊的紫外吸收光谱，其最大吸收峰位于260nm处。 根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度 纯DNA：A260/A280=1.8（＞1.8RNA污染；＜1.8蛋白污染） 纯RNA：A260/A280=2.0 （若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低） 纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量 260nm处OD值为0.01相当于500ng/ml dsDNA 或330ng/ml ssDNA 或400ng/ml RNA 或200ng/ml寡核苷酸 DNA的紫外吸收光谱 天然DNA 变性DNA 核苷酸总吸收值 1 2 3 220 240 260 280 0.1 0.2 0.3 0.4 波长（nm） 光吸收 1 2 3 增色效应（hyperchromic effect）：核酸变性后，粘度降低，紫外吸收值增高，生物功能消失，这种现象称为增色效应。 减色效应（hypochromic effect）：复性的DNA溶液紫外吸收下降称为DNA的减色效应。 核酸紫外吸收值比其各核苷酸成分的紫外吸收值之和减少30％-40％的现象。 3.3 核酸的变性和复性 3.3.1 核酸的变性（denaturation） 概念 核酸的变性是指在一定物理或化学因素的作用下，核酸双螺旋结构中碱基之间的氢键断裂，变成单链的过程。 结构的氢键和疏水键断裂，双螺旋结构解体，但不涉及核苷酸间共价键的断裂。核酸变性后，粘度降低，紫外吸收值增高（增色效应），生物功能消失。 影响变性的因素 破坏双螺旋稳定性的因素都可使DNA变性。 DNA分子中的碱基处于配对和不配对的动态平衡状态，很多因素会引起它向不配对方向转变，即引起DNA变性。如高温、强酸、强碱、重金属盐、有机溶剂如 (乙醇、丙酮等)、尿素、酰胺等试剂、射线、超声波、剧烈振荡等。 高温：DNA稀盐溶液加热到80~100℃，几分钟内双螺旋键即解开，形成无规则的线团。由温度升高引起的变性称热变性。 离子强度：提高溶液的离子强度，可中和DNA分子链上磷酸基团的负电荷，降低它们之间的排斥力，稳定DNA的结构，起到防止变性的作用。 极端的pH值：pH﹤1时，DNA的磷酸二酯键会被水解；pH﹥11.3时，DNA的所有氢键断裂。 由酸碱度改变引起的称酸碱变性。 疏水作用：甲醇可增加碱基的溶解度，三氟醋酸钠可降低DNA分子疏水作用，破坏双螺旋结构引起变性。 尿素及甲醛：它们可与碱基之间形成氢键，是核酸的变性剂。前者常用于聚丙烯酰胺凝胶时DNA的变性，后者常用于琼脂糖凝胶电泳中RNA的变性。 碱基堆积：氢键和碱基堆积是一致的，碱基堆积是一种协同作用，处于中间的碱基比两边的碱基稳定，线状双链DNA分子的两端常有7个未配对的碱基，因此少于15bp的双链DNA片段极不稳定。 DNA的熔点（ Tm ） DNA的热变性过程中光吸收达到最大吸收一半时的温度称为DNA的解链温度( melting temperature，Tm) 或熔点。 双螺旋结构失去一半时的温度。 DNA的Tm值一般在70~85℃之间。 热变性是在很窄的温度范围内突发的跃变过程。 很像结晶达到熔点时的熔化现象，故名熔解温度。 影响DNA 的Tm值的因素： DNA的均一性 变性的DNA链各部分的氢键断裂所需能量较接近，Tm值范围较窄，反之亦然。 DNA分子中碱基组成的均一性：只含有一种碱基对的多核苷酸片段，比天然DNA的Tm值范围窄。因它在变性时的氢链断裂几乎可“齐同”进行，故所要求的变性温度更趋于一致。 待测样品DNA的组成是否均一：如样品中只含有一种DNA，其Tm值范围较窄，若混杂有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽。原因也与DNA的碱基组成有关。 DNA的(G+C)含量 不同生物中（G+C）含量: 20% - 80% DNA中(G+C)含量高能增强结构的稳定性，破坏G-C间氢键需比A-T氢键付出更多的能量。