固定化酶连续拆分DL蛋氨酸研究.pdfVIP

固定化酶连续拆分D,L-蛋氨酸 蒲广西 陈海宁 孙嘉琳 梁国栋 海南国栋药物研究所有限公司 海口 571101 摘 要 目的 研究利用基因重组工程技术构建高活性的氨基酰化酶工程菌连续拆分D,L-蛋 氨酸 方法 氨基酰化酶工程菌经发酵收集高活性的菌体 通过海藻酸钠包埋技术制备固定化 酶 连续拆分D,L-蛋氨酸 结果 利用基因工程构建的工程菌表达氨基酰化酶 比酶活性大于 6000/g湿菌体 酶柱比酶活性大于4000/g酶 半衰期20天 可连续拆分24天 拆分率达 90%收率达74.5%左右 结论 利用基因工程技术构建工程菌表达的氨基酰化酶活性高和拆分 率高 关键词 氨基酰化酶 拆分 蛋氨酸 0 引言 蛋氨酸是一种含硫最丰富的氨基酸 在大多数蛋白质中含量高达2 4%是一种必需氨基酸 在生物化学甲基化中起重要作用 近年来 随着科技的飞速发展 L-蛋氨酸的用途越来越广泛 在医学上 可作为蛋白质缺少的病人或蛋白质吸收不足的肝脏病人的蛋白质营养补充剂 还可 治疗婴儿布疹 以及肌醇 胆碱配合可用来治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化等病症 工业上 蛋氨酸还具有乳化性 可用于照相技术中 随着L-蛋氨酸应用领域不断发展 其市场需要也在 飞速增长 氨基酰化酶 EC4的立体特异性是L-型 可将化学合成的 N-乙酰-D,L-蛋 [1] 氨酸拆分 水解 从而获得L-蛋氨酸 Chibata等 首先发现米曲霉的氨基酰化酶具有良好的 专一性 从而代替了由动物的肾脏提取氨基酰化酶 自60年代末日本DEAE-Sephadex作载体将 [2,3] 此酶固定化实现了工业化生产L-氨基酸以来 不断推出固定化氨基酰化酶新的研究成果 它 们都采用载体固定酶法 从酶的提取 精制到固定化 工艺复杂 要求低温条件 而且有时不 稳定 价格昂贵 国内 也有用固定化米曲霉菌体拆分D,L-蛋氨酸 王淑豪等人用固定化米曲 [4] 霉氨基酰化酶连续拆分D,L-蛋氨酸 比酶活性为620/g酶 宋正孝等人用固定化米曲霉菌 [5] [6] 体拆分蛋氨酸 以及王晓平等人利用提取米曲霉氨基酰化酶拆分D,L-蛋氨酸 本文利用基因 重组工程技术构建氨基酰化酶工程菌 比酶活性大于6000/g湿菌体 采用海藻酸钠包埋技术 制备固定化酶 其比酶活性大于4000/g拆分率达90%酶解液经分离精制而得L-蛋氨酸 收率高达74.5%左右 居国内外先进水平 1 材料与方法 1.1实验材料 1.1.1菌种 氨基酰化酶工程菌 GD301由海南国栋药物研究所基因室提供 1.1.2发酵培养 % 1 KHPO 0.6 NaHPO 1.2 NaCl 0.1 2 4 2 4 NHCl 0.2 MgSOHO 0.05 维生素B 0.002 4 4 2 1 氨苄青霉素 0.005 葡萄糖 1.2 丁二酸钠 1.2 灭菌条件121 20分钟 1.1.3原料 N-乙酰-D,L-蛋氨酸(N-AC-D,L-Met)由自己合成(略) 1.2实验方法 1.2.1菌体培养 30L发酵罐装入20L液体发酵培养基 灭菌后 按 10%的接种量接种 于30 培养24h取样测定发酵情况 当比酶活性大于6000u/g菌体 残糖 还原糖 小于0.1% 可停止培养 离心收集菌体 1.2.2固定化菌体制备 用0.1M磷酸缓冲液 PH7.20溶解菌体 常温搅拌1-2h然后加入2%的甲苯 继续搅拌 1-1.