精氨酸脱亚胺酶发酵过程特性及其产生机理研讨.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四捉全国发酵工程学术甘论套论文集 精氨酸脱亚胺酶发酵过程特性及其产生机理研究 李加友1， 曹瑜2，焦庆才2 (1．鲁东大学生命科学学院．山东烟台264025；2．南京大学生命科学学院t江苏南京210093) 摘要：精氨哦脱亚胺酶有较好的体内体井肿瘤生长抑制作用，对其生产菌株的发酵特性 及产生机理研究是精氟破脱亚胺酶规模利用与研究的基础．粪肠球菌(Enterococcusfa鲫· lis)NJ402的发酵过程特性表明，苗体生长过程碳弹物质代谢产生乳酸而导致环境pH的下 降．而培养基中L-精氨酸的转化产氨有利于环境pH的稳定和菌体的生长，此过程与精氨酸 脱亚胺酶的表达产生有关。通过井耀pH稳定捌曲加入及能量代谢受阻安验进一步证实， NJ402苗体表达产生精氨欧脱亚胺睥的直接辱国是环境pH的变化． 前言 精氨酸脱亚胺酶是一种新型的肿瘤细胞体内体外增殖抑制剂[1-s]。对于绝大部分产 生精氨酸脱亚胺酶系(ADs)的菌株来说，L一精氨酸的添加对于ADS系统各组成酶的催 化活力o～．对于某些细菌来说，通过ADS代谢L一精氨酸可能是一条重要的产能途 径口。]．尤其是在苗体正常产能代谢受阻的时候，ADS的产能对于菌体的生存就显得很意 义n‘”。但是，也有实验表明L一精氨酸代谢是为了适应环境酸碱条件的变化。ADs通过 代谢L·精氨酸产氨为菌体提供了很好的耐酸能力．因此认为环境pH对苗体产生ADS 以及ADS系统各酶的活力有直接的影响[I“”。 的细胞生长、发酵特性以及ADl产生与各变量之间关系的研究，对ADI发酵过程进行科 的发酵过程，也为其发酵放大生产提供依据。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1菌株 粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)NJ402，本实验室保藏。 1．1．2仪器设备 UV一ⅥS检测器(日本岛津公司)；示差检测器()I 10ATvp高效液相色谱仪、SPD-IOAvp N2000色谱工作站(浙江大学)IC18柱(150×4．6ram)(美国Merck公司)；恒温调速培 养器(江苏太仓)；10L全自动发酵罐(江苏镇江)。 1．1．3试荆 李加友等：精氪酸脱亚胺酶发酵过程特性及其产生机理研究 L一精氨酸和L_瓜氨酸由上海医药试剂公司提供l蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和玉米浆为 生化试剂}乙腈为色谱纯}其它试剂均为分析纯。 1．2精氨酸脱亚胺酶发酵 取摇瓶种子培养液以5％按种量接人10L发酵罐中，于37℃恒温培养12h，搅拌转 速为300rpm，通气量loL／min。在相关因子的考察实验中，其测定值以需要而定。 1．3精氨酸脱亚胺酶的体积发酵效率测定 6000 rpm离心收集发酵液中的菌体，蒸馏水离心洗涤二次(若有需要，则沥干水后称 6．5) 量菌体湿重)，将所收集的湿菌体全部转入适当体积的L一精氨酸溶液(o．5M，pH 中。立即置于振荡器中37℃恒温振荡3h，测定转化液中新生成L一瓜氨酸的量D日。一个 单位酶活(1u)定义为在上述条件下1 L一瓜氨酸的酶量，以1mL发 rain新生成1#tool 酵液所含酶活单位数量即比酶活(U／mL)作为比较不同发酵条件对精氨酸脱亚氨酶活力 影响的指标，即为体积发酵效率。 I．4乳酸测定方法 流动相采用0．005mol／L的H2SO．溶液．流速0．8ml／min，检测波长210nm，进样 量20 p1，柱温为室温，信噪比设为3。流动相使用前通过了0．45pm孔径的合成纤维素 酯膜进行真空过滤．并超声波脱气。标准曲线绘制：准确称取标准样乳酸0．1355 g，用重 蒸水定容到lOOmL容量瓶中．作为标样贮备液。然后分别从中吸取1、3、5、7、9mL， 加人到10 mL容量瓶中，定容，即为进样试液。分析时每次进样20“1，每个浓度进样5 次测定，取其平均