非水相生物转化葛根素的耐有机溶剂极端微生物的筛选研究.pdfVIP

非水相生物转化葛根素的耐有机溶剂极端微生物的筛选 1 1 1 1 1，2 1 储建林 ，张森 ，张君颖 ，朱清禾 ，吴薛明 ，何冰芳 1 2 （南京工业大学制药与生命科学学院，南京210009 ； 南京中医药大学药学院，南京 210046 ） 摘要：非水相催化在天然产物的生物转化中可显著提高非极性底物溶解度，大幅度提高转化特异性和生产 率等优点，使生物转化工艺更具实用价值。为了改善葛根素的水溶性，进而改善其药理活性，从已建立的 耐有机溶剂菌库出发，以30% （v/v ）的DMSO 体系进行非水相生物转化葛根素，转化产物经HPLC 分析， 筛选得到一株可能糖基化葛根素的菌株3th QA1-2 。通过生理生化反应以及16S rDNA 结果分析，3th QA1-2 菌株鉴定为节杆菌。节杆菌在30℃，pH6.0 条件下，以6g/L 葛根素为底物，转化时间48h ，得到转化产物 T1-puerarin ，转化率约45% 。转化产物T1-puerarin 经制备HPLC 纯化，质谱分析，其分子量为578，与底 物葛根素相比增加了一个六碳六氧糖基 162，推测为葛根素的单糖基化衍生物，为非水相高效转化葛根素 奠定了基础。 关键词：非水相；生物转化；葛根素 1 前言 中药的现代化和国际化需要引入新思路、新方法和新技术。对于复杂结构的天然活性成 分来说，利用化学合成来进行结构修饰存在着得率低、反应专一性差、副产物多等缺点，特 别是有些反应目前利用化学手段较难实现，生物转化技术却可弥补化学合成的不足。天然先 导化合物很多是脂溶性物质，这些原料若能在有机溶剂中进行反应，可以提高底物的溶解度 和反应速率。大自然的驯化赋予微生物以多样性，耐有机溶剂极端微生物由于能适应有机溶 剂对细胞的毒性或结构破坏而具有独特的抵抗恶劣环境的多种能力。由此产生的酶，尤其是 胞外酶多数具有较强的耐有机溶剂的特性，可在高浓度（比例）的有机溶剂中朝着逆反应—— 脱水缩合的方向进行，用于催化肽类合成、糖基转移等缩合及脂交换反应。天然产物在非水 介质中的转化已引起众多科学家的重视[1-4]，已成为天然产物转化的热点之一。 葛根素（Pueratin ）是从豆科植物野葛或同属植物根中提取的一种有效成份，为异黄酮 类化合物，目前在临床上已被广泛应用于心脑血管系统疾病、糖尿病等疾病的治疗。葛根素 溶解度较低(6.24g/L) ，为了改善葛根素的水溶性，进而改善其药理活性，Ye 等人报道了一 株哈茨木酶的葛根素微生物转化，获得了抗氧化活性提高 20 倍的 3′-羟基葛根素[5]。Li 等 人利用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的麦芽糖淀粉酶对其进行结构修饰，得到两种主要产物葡萄 糖基-α- （1，6 ）-葛根素及麦芽糖-α- （1，6 ）-葛根素的溶解度分别是葛根素的 14 倍和 168 倍[6]。本文采用极端微生物进行非水相生物转化葛根素制备其糖基化衍生物。 2 材料与方法 2.1 供试菌株 本实验室耐有机溶剂菌种库 基金项目：863 重点项目（2007AA021306） 作者简介：何冰芳，通讯联系人，教授，博士生导师，E-mail: bingfanghe@njut.edu.cn 2.2 培养基 发酵培养基：蔗糖15g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，玉米浆1.5mL/L，KH2PO4 1g/L， MgSO4 0.5g/L ，pH 7 。 LB 培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L ，琼脂20g/L, pH 7.2 。 2.3 实验方法 2.3.1 菌种的活化 将冻存的耐有机溶剂微生物按无菌操作分别接种于LB 培养基上，于30℃培养箱内分别 培养24h 。 2.3.2 接种培养 将活化后菌种接种于发酵培养基中（250ml 三角瓶，50ml 装液量），于 30℃，160rpm 下摇瓶培养12h。 2.3.3 转化方法 , 取培养12h 后的发酵液加入 150mL 带塞三角瓶中，转化体系20ml ，DMSO 30% （v/v ） 葛根素10g