蛋鸡α干扰素基因的克隆与在大肠杆菌的高效表达与复性研讨.pdfVIP

家禽传染病 蛋鸡Q一干扰素基因的克隆与在大肠杆菌的高效表达与复性研究 马风龙1李朝阳2乔彦良1傅兴伦l赵怀龙l贾世玉l陈如明1陈国柱 基因，定名为ChlFN．Sl，与Gene 诱导，收集菌体超声波破碎后提取包涵体并进行初步纯化，利用胱氨酸一半胱氨酸再氧化法对纯化后的包 涵体变性液进行分段稀释法复性。细胞病变抑制法(CEF-VSV为基本检测系统)测定复性液的抗病毒比 活性高达105单位lmg以上。 关键词：鸡IFN．Ⅱ基因表达包涵体复性 家禽肿瘤和病毒感染性疾病的有效治疗一直是困扰禽病防治的重大难题之一。鸡的免疫系统以及在病 原感染或注射疫苗时所产生的免疫反应与哺乳动物相似，所以可考虑应用细胞因子来控制疾病。相对来说， 禽类的饲养简单、廉价．出笼时间短，而且数量较大，这就需要考虑所用疫苗或者治疗药物的经济价值。 绿色食品工程的启动，人们对食品安全重视的升温，常用的抗病毒类药物带来严重的药物残留，危及人类 的健康，得到社会的普遍关注。所以，养禽业迫切需要新一代天然治疗方法。在病原感染和疫苗免疫中， 干扰素等细胞因子可调控免疫反应的类型与程度，是一种高效、天然的治疗方法。而按照传统方法进行治 疗，很难在短时间内控制病情，而使用基因工程干扰素则可抗病毒增殖，抗肿瘤生氏，并能提高免疫力， 在临床上应用。不但效果明显，而且无药物残留，能够在病毒性感染的早期对其进行有效的治疗。 本项目选择干扰素的基因工程表达产物及建立多剂型工厂化生产工艺作为研制目标，开发新型绿色高 效抗病毒感染生物制剂，实现基因工程表达干扰素产品产业化，填补国内该领域的一项空白，市场前景广 阔，具有巨大的社会和经济效益。 1材料与方法 1．1材料 公司． I、EcoRl等限制性内切 试剂：高保真pfi,DNA聚合酶(Promega)及相应的PCR回收试验盒、BamH 酶和IPTG、X．gal(均为TaKaRa产品)等分别自相关生物公司。 1．2方法 1．2．1基因组DNA提取 参照文献资料介绍的方法[I,21从莱航鸡肝组织中提取基因组DNA。 1．2．2 ChlFN-Gt基因片段的扩增 根据gene PCR反应条件为： 个循环；最后72℃延伸5rain。1％琼脂糖凝胶屯泳，观察PCR扩增结果。 1．2．3 PCR产物的回收与序列测定 Star软 进行回收后，克隆入pMDl8-T载体中，鉴定后制备质粒送大连宝生物进行序列测定，并利用DNA 件进行基因序列分析。 112．4ChlFN．Q重组表迭质粒的构建0,2I 884 第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 ‘ 重组表达质粒，转化JMl09，小量快速抽提质粒进行PCR和酶切鉴定。 1．2．5表达载体的诱导表达 4．5．-6h，进行诱导表达。培养结束后，取表达菌体离心，收集菌体沉淀用lmmolFLTHs．HCI悬浮后，加样 扫描仪，对上述SDS电泳蛋白带进行凝胶薄层扫描． 1．2．6包涵体的提取与溶解I’I 取大最诱导细菌培养物432 r10mmol／LTris 5000rpm离心15min，收集菌体，重悬于TEl HCl(pH8．O)， 包涵体。最后用含有7moVL盐酸胍的缓冲溶液溶解包涵体。80009离心后收集上清即为表达干扰索变性 液。 1．2．7表迭蛋白的复性与纯化l 采用胱氨酸一半胱氢酸再氧化法对纯化后的包涵体变性液利用分段稀释法进行复性。具体的操作如 步加入到磁力搅拌的含有不同浓度(O．5，1．0，1．5，2．0 mol／L)盐酸胍的复性液中f还原型半胱氮酸3mmoVL， 氧化型胱氨酸0．5mmol／L，Iris-HCI 10mmoVL(pill0