ERICPCR和RAPD技术在弧菌遗传多样性分析中的应用研究.pdfVIP

中国甲壳动物学会编辑 甲壳动物学论文集 第四辑 钳半虫．敖扛2003年出版 TRANSACTIONS OFTHECHINESECRUSTACEAN乳)CIETYNo．4 PP．341～347 陈 偿 胡超群 张吕平 陈晓燕 沈 琪 任春华 (中国科学院南海海洋研究所，广州 510301，E—mailantonychenl@sina．corn) 摘要：本研究以溶藻弧菌为材料，利用RAPD和ERIC—PCR技术对不同宿主、不同环境分 离的8个溶藻弧菌株系进行了遗传多样性分析，RAPD使用了8个引物共获得了46条多态 性条带，将8个侏系分为3个类群；用ERIC—PCR扩增共得到55个多态性条带。不同侏系 的扩增条带数量分布均匀。不同环境．不同宿主来源的溶藻弧菌具有较大的多弹性． R．-MPD和ERIC—PCR获得的结果十分接近，但ERIC+PCR操怍更加方便，结果也更加稳定， 有可能成为今后弧菌及有关细菌遗传多佯性分析的重要工具。 关键词：RAPD ERIC．PCR遗传多佯性溶藻弧菌 弧菌是危害海洋水产养殖业最严重的病原菌之一，在养殖鱼(吴后波，19．97)、虾 eta1．，2002)都有过大规模爆发的报道。近年 (Lightner，1975)、贝类(Luna—Gonzalez 来，养殖高密度化，养殖水环境的严重污染等不和因素为弧菌病的持续爆发创造了条 件。因此，深入地了解弧菌在环境中的演化、变异和种群多样性及流行特征具有重要的 意义。现代分子生物学方法中有多种可以精确地跟踪分析病原菌的流行和分布，主要有 噬菌体分型(Barker，1980)、质粒谱分析(Threlfal[et et et et a1．，1994)、脉冲凝胶电泳(Olasena1．，1994)、RAPD(welsha1．，1990)和 et ERIC．PCR(Vesalovec 种应用广泛的DNA指纹分析技术，这个技术用8～10mer的短小引物进行随机PCR扩 增，扩增产物电泳后的带型就能反映不同菌株的变异特征。肠细菌重复性基因间保守序 有效的工具。它是用一些在基因组中随饥分布的短的重复序列作为PCR扩增的引物， 分析细菌DNA多样性。因此本研究以溶藻弧菌为材料，比较这两种技术在分析弧菌遗 传多样性方面的应用。 一、材料与方法 1．细菌株系来源 研究细菌抹系来源见表1。 2．细菌总DNA的提取 ·343· 表1溶藻弧菌株系来源 Tab．1Thesoun璐of s删IlsforRAPD V．．Z蓼nolyaaa 取试剂盒说明书进行操作，提取总DNA，然后取5止离心后的上清液，1％琼脂糖凝胶电 泳，溴乙锭染色，照相，剩余样品贮存于一20E备用。 3．样品的扩增 取l扯【总DNA样品为扩增模板，PCR反应混合物的组成如下：50mmol／LKCl，10 mmol／L retool／LTris．HCI(pH8．8)，1．5 U吼她Ex 200“mot／L，0．25扯moi／Loligo引物，2．0 Taq酶，终体积25#1(以上试剂购 上扩增，扩增前先于94℃变性3min，然后94℃变性lmin，3612退火lmin，72℃延伸2 min，共40个循环，结束后置于72℃继续温育i0min。扩增完成后，1％琼脂糖凝胶电泳。 表2 RAPD扩增使用的随机引物 Tab·2．The ofrandom selectedforRAPD sequences p