广西棘蛙属3种棘蛙线粒体12SrRNA基因的序列分析.pdfVIP

148 广东职业技术教育与研究 2012年第4期 广西棘蛙属 3种棘蛙线粒体 12SrRNA基因的序列分析 张碧文 (湛江卫生学校，广东湛江524037) [摘 要] 本研究主要以广西棘蛙类为研究对象，应用PCR方法扩增线粒体 12SrRNA基 因的DNA片 段 ，进行 DNA序列测定，并运用ClustalX(1．83)、MEGA3．1、PAuP4．0bl0等软件对DNA序列数据进行处理分 析。结果表明：研究的广西棘蛙类可分为棘胸蛙类群、棘腹蛙类群和棘侧蛙类群3支。 [关键词] 棘蛙属 线粒体 12SrRNA基因 序列分析 长期以来，两栖类传统的系统学和系统发育研究主要 两栖动物的系统发生是有用的。江建平等测定 了中国蛙科 是形态解剖特征 ，生物学性状 以及生物地理学信息等 。因 动物 24种和蟾蜍科的中华大蟾蜍线粒体 12SrRNA基 因 为外部形态等比较直观 ，容易得到。这些分类依据在大多 长约400bp片段的序列．对中国蛙属的分类系统进行了探 数情况下能清晰反映一个物种的分类地位或系统发育关 讨 ，认为把陆蛙属 、大头蛙属 、虎纹蛙属 、棘蛙属 、臭蛙属 、 系。但是 ，随着科学的发展 ，也遇到了一些传统方法难以解 粗皮蛙属和侧褶蛙属从原来的蛙属分出有其合理性。并认 决的困难。例如 ，有时对一些近缘种则很难确定其分类地 为从分子证据看 ，合江棘蛙与棘腹蛙关系更近 。与棘胸蛙 位，对于种群，生态型的研究更是如此。寻找更精细的分类 较远。这与其形态表征基本一致。同时认为棘蛙属与大头 特征，比如，局部身体形态、分布等，则容易将一些非遗传 蛙属关系较近．前者可能由后者进化而来。但棘蛙属物种 稳定的性状当作分类特征。再如 ．由于物种间可供比较的 之间的相互关系以及棘蛙属动物的分类阶元地位仍未解 形态学性状是有限的，一些进化距离较远的类群难 以统一 决 [3]。故对棘蛙属的分子系统学研究有非常大的研究意 分析 ，这对于高级分类阶元的研究尤为突出；由于趋同进 义 化 (ConvergentEvolution)的存在 ，不同类群 的物种可能表 1 材料与方法 现出相似的形态特征。为了解决这些困难 ．一些新的学科 技术渗透进入物种的分类研究。其中线粒体DNA标记在 1．1 材料 两栖类研究中的应用得最为普遍。 本研究所用材料分别来 自广西壮族 自治区和云南 根据mtDNA的歧异程度，计算遗传距离，推算出亲缘 省 ，内群棘蛙属有 4个种 ，外群有两个种 ，共 6种蛙 ，28 关系。随着 PCR技术及全 自动测序技术的推广，两栖类分 个样。除云南省 的样品是用无水 乙醇浸泡保存外 ，其余 子系统学研究工作 目前主要集中在 DNA的序列分析上。 的均为新鲜肌肉，置于一70~C保存。实验所用样 品(见表 Hedges等[]和 Hay等[2]已经证明 12SrRNA基因对于研究 1)。 表 1 供试材料名称及来源 1．2 方法 1．2．2 12SrRNA基因的扩增 12SrRNA基因片段扩增引 1．2．1 基因组 DNA的提取 采用蛋 白酶K法提取总 物的设计参考，12SrRNA基因引物：①L1091[5]—— 5-AAA DNAE。 AAGCTTCAAACTGGGATIAGATACCCACTAT-3；②H1487cs] 150 广东职业技术教育与研究 2012年第4期