实验七 微生物的分离纯化与平板菌落计数(二).ppt

实验七 微生物的分离纯化与平板菌落计数（二） 一、目的要求 ? 1. 了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。 ??2. 掌握倒平板的方法和平板划线分离的基本操作技术。 二、分离纯化基本原理? 自然界中的微生物是各种类微生物的混合体，因此，为了研究某微生物的特性，或者要大量地培养和利用某微生物，必须把它们这些混杂的微生物群中分离出来。从而获得某一菌株的纯培养。这种获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。 为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养，酸碱度，氧等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其它杂菌，再通过各种稀释法（平板稀释法，平板划线法等），使它们在固体培养基上形成单菌落，从而得到纯菌株。 平板菌落计数法基本原理? 平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。 菌落形成单位(colony-forming units，cfu) 表示样品的活菌含量。 三、器材? 牛肉膏蛋白胨培养基；伊红美兰培养基。 ?盛9毫升无菌水的试管；无菌吸管；无菌培养皿；样品等。 四、平板菌落记数法操作步骤? （1）编号 取无菌培养皿6套，分别标明为10-4、10-5、10-6各二套，另取6支无菌试管水（上次准备）分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 （2）制备稀释液： 用1毫升无菌吸管吸取一毫升样品注入盛有9毫升无菌水的试管中，吹吸三次，并振摇使之充分混匀。然后再用一支吸管从此试管中吸取一毫升注入另一盛有9毫升无菌水的试管中，以次类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的各种稀释度的菌悬液。  （5）培养：倒置37℃培养24-48h ?2.平板划线分离法： （1）倒平板:伊红美兰培养基熔化后冷却到60度倒入无菌培养皿,每组4皿，室温放置至凝固。 （2）划线：划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成分散的单个菌落。 接种环取菌液划线,每位同学1付  平板划线法 (3)培养:平板倒置于37 ℃ ,培养24-48h （4）挑菌：挑取紫黑色带金属光泽的单菌落接入斜面试管(每人1支标记备用，下次生理生化试验用)。 EMB agar 五、结果与思考? ?1.在平板划线法中，为什么每次都需要将接种环上剩余物烧掉？ ???2.为什么要把培养皿倒置培养？ 3. 同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？ ??? 配微生物生理生化反应用培养基 1-2组各配糖发酵培养基200 ml，分装20支试管，5cm高度，每支内倒放杜氏小管1支。 3-4组各配吲哚培养基200 ml，分装20支试管。 5-6组各配产H2S培养基300 ml，分装20支试管。 一半高度。 7-8组各配甲基红试验培养基200ml，分装20支试管。 9组配淀粉水解试验培养基500ml，装入2只250ml三角瓶。 培养基配方 1.糖发酵试验培养基（液体） 蛋白胨10g，NaCl 5g ，葡萄糖10g，水 1000ml ，PH7.4-7.6 ，加1.6%溴甲酚紫1-2ml， 121℃，灭菌20min 2. 产H2S 试验培养基（固体 ） 蛋白胨20g，NaCl 5g，柠檬酸铁铵 0.5 g ，硫代硫酸钠 0.5 g ，琼脂 15g ，水 1000ml ， PH 7.2 ， 121℃ ，灭菌20 min 培养基配方 3. 蛋白胨水培养基（吲哚试验，液体） 蛋白胨10g， NaCl 5 g ，水 1000ml， PH 7.6 ，121℃灭菌20min * * 1.稀释样品 1 ml 9 ml 原液 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 2. 取 0.1 ml （4）倒平板 牛肉膏蛋白胨培养基熔化后冷却至45oC,倒入每付平板约15-20 ml，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，室温放置至凝固。 （3）取样 吸取10-4、10-5、10-6这三个稀释度的菌液各0.1ml，对号放入编号号的无菌平皿中。 （6）记数：挑选三个稀释度中菌落数目合适的（30-50个）计数，算出同一稀释度2个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算： 每毫升样品中有菌落形成单位（cfu）=同一稀释度二次