早期肺癌病人血液中p53的克隆及其pEGFP-N1-p53的构建.pdfVIP

第 32卷 第 2期 河 南 科 技 大 学 学 报 ：自然 科 学 版 Vo1．32 NO．2 2011年 4月 JournalofHenanUniversityofScienceandTechnology：NaturalScience Apr． 2011 文章编号 ：1672—6871(2011)02—0056—04 早期肺癌病人血液中 p53的克隆及其 pEGFP—N1一p53的构建 李振红 ，雷雪芹 ，徐廷生 ，张广平 ，韦光辉 ，索剑飞。 (河南科技大学 a．动物科技学院；b．第一附属医院，河南 洛阳 471003) 摘要 ：首先用 RT—PCR方法从早期肺癌病人 的外周血中克隆出人抗癌基 因p53，经测序确认为野生型后 ，通过 酶切 、连接、转化构建 出扩增质粒 pMD18-T-p53，然后构建 出含增强型绿色荧光蛋 白(EGFP)基 因的真核表达 质粒 pEGFP—N1-p53。pEGFP—N1一P53经 限制性 内切酶HindIII和BamHI酶切 ，酶切产物电泳结果显示的两个 片段(1188bp和4695bp)和实验预期相符 ，测序结果表明：获得野生型人抗癌基 因p53并构建了真核表达载 体 pEGFP—N1一p53。 关键词：人抗癌基 因p53；克隆；真核表达载体 ；增强型绿色荧光蛋 白 中图分类号 ：Q782；Q819 文献标识码 ：A U^ —刖_‘—再J— 癌症是人类公认的最致命的杀手之一。根据国际癌症研究中心 (IARC)报告 ，癌症发病人数以年均 3％ ～5％的速度递增，发病及死亡人数与 10年前相比分别增长了24．7％和 19．2％，预计到 2020年全 球将有2000万新发病例，死亡病例将达 1200万例 ¨。但癌症的治疗仍然是世界性难题 ，单一地手术 治疗容易造成病灶 的转移，而放化疗带给患者巨大痛苦 的同时会抑制骨髓功能 ，引起全血细胞减少 ，红 细胞减少引起贫血 ，白细胞减少造成感染 ，血小板减少引起出血 ，任何一项发生都可能危及生命 。现代 医学尝试采用基因疗法预防和治疗癌症，其中，克隆出抗癌基 因p53并构建其真核表达载体是必要的前 提之一。 绿色荧光蛋 白(GFP)源于海洋水母，文献 [2]发现该蛋 白由238个氨基酸组成 ，在热、极端 pH和化 学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光 ，但在还原环境下荧光会很快熄灭。 目 前增强型的绿色荧光蛋 白基因(EGFP)的荧光强度提高了35倍 ，而且激发 16～24h后仍可稳定 的测定 荧光 ，成为国内外生物化学和细胞生物学中继 lacZ、CAT后应用最广泛的报告基因之一 。真核表达 载体 pEGFP．N1除了含有该报告基因的优 良特性外 ，还能将克隆至其中的 目的片段高效表达 ～ 。孙 晓艳等 构建了真核表达载体 pEGFPPDX一1，将 PDX-1插入 pEGFP—C1的C2末端，提高了PDX一1在真 核细胞 中的表达。索剑飞等 将人胰岛素基因成功插入 了pEGFP—N1表达载体。近年来 ，科研人员用 野生型p53对多种肿瘤细胞进行体外细胞表型逆转实验。高振强等 发现逆病毒载体介导 的野生型 p53基因局部注射结合药物治疗可能是治疗肺癌的有效方法 。滕理送等 ¨用 电穿孔法将正 向携带野 生型 p53基因cDNA全长的反转录病毒重组质粒 (Dolp53)导入 p53基因突变的人肠癌细胞 SW11b，证 明人野生型 p53基因对肠癌细胞有明显 的抑癌效应。许小平等 “将重组逆转录病毒载体介导的人野 生型 p53cDNA转染 白血病细胞HL60-N。绿色荧光蛋 白载体和抗癌基因 p53的应用研究 已经相 当广 泛，但是将绿色荧光蛋白载体和抗癌基因p53结合的研究国内外鲜有报道 ，借鉴前人的经验 ，本文采用 含有增强型 GFP为报告基因的真核表达载体pEGFP—N1作为抗癌基因p53转染的载体。 基金项 目：河南省科技攻关项 目(082102130001)；河南省基础与前沿技术研究计划项 目(072300430010) 作者简介 ：李振红 (1984一)，男，河南睢县人，硕士生；雷雪芹(1962一)，女，河