预设CDR3导向噬菌体抗体库筛选人源化抗人整合素αvβ3单抗E10研究.pdfVIP

中文摘要 摘 要 噬菌体抗体库是把体外随机组合的全套抗体基因呈现在丝状噬菌体表面，通过抗原 的亲和力选择和噬菌体扩增获得特异性抗体基因的技术。该技术已广泛用于制备人源单 克隆抗体及免疫学研究。本研究在 “抗原定向选择法”人源化鼠单抗的基础上探讨了一 种新的人源化技术路线，即预设CDR3导向噬菌体抗体库技术，对抗人整合素avi3l单 抗E10进行人源化。获得了以下结果: 1.从分泌抗人整合素。vf3单抗的杂交瘤细胞E10总RNA中，应用RTPCR技术扩 增单抗可变区VH和VL基因，DNA序列测定表明V。和VL基因分别属于IgGI和VKIII 亚群。 2.将VH基因与人重链恒定区CHI基因连接，VL基因与人CK连接，分别构建了鼠 /人嵌合重链FD基因和轻链基因。将它们克隆入pComb3，构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体 抗体表达载体，用辅助噬菌体VCSM13超感染，间接ELISA及竞争抑制ELISA证实表 达了能特异性结合人整合素avfrj}蛋白的鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体。 3.根据鼠单抗序列合成含鼠CDR3区的寡核普酸引物，应用重叠PCR及DNA重 组技术，将抗人整合素av3(3单抗E1。的CDR3区与人淋巴细胞来源的多样化的VH和 VL组合，构建含E10CDR3的人重链FD和轻链基因。将鼠/人嵌合FD基因和人轻链基 因克隆到pComb3载体中，电转化大肠杆菌构建杂合噬菌体抗体库，库容为2.1x1护， 经辅助噬菌体VCSM13超感染的噬菌体抗体库滴度为8.96xl口气fulmLo同时含有轻链 基因的噬菌体占80%。用整合素avj33抗原进行四轮的吸附一洗脱一扩增，特异性噬菌 体抗体明显得到富集。挑选第四轮筛选后的30个克隆进行ELISA检测，获得10个能 够与整合素av3[3特异结合的克隆。竞争抑制实验显示，其中3个与亲本鼠单抗识别相 同的抗原表位。其中，高亲和力B12克隆DNA序列测定表明，所获得的人源化噬菌体 抗体轻链基因具有典型的人免疫球蛋白基因结构特征。同源性分析及胚系基因分析表明 轻链基因为VKIII基因家族。 4.同法将人重链FD基因和人源化B12克隆轻链基因克隆到pComb3载体中，构 建了库容为2.10人源噬菌体抗体库，滴度为2.14.10cfu/mL。人重链FD基因插入率 为50%。用整合素avg3抗原进行三轮的淘筛，经间接ELISA和竞争抑制实验证实，获 得了3个与亲本鼠单抗识别相同的抗原表位且能够与整合素。vf3特异结合的克隆。高 亲和力 D5克隆DNA序列测定表明，所获得的人源化噬菌体抗体重链FD基因具有典 型的人免疫球蛋白基因结构特征。同源性分析及胚系基因分析表明该基因为IgGI亚 类。可变区属VH1基因家族。 本研究通过鼠CDR3对人抗体库的限定，使所获抗体库具有预定的偏向性 有利于 特定抗体的筛选。初步证实该鼠单抗人源化方法是切实可行的。 关键词: 噬菌体抗体库:鼠单抗人源化:整合素。vs3 Abstract Abstract Molecularcloningofantibodyrepertoireincombinatorialphagedisplayvectorhas turnedouttobeapowerfurtechniqueforobtaininghumanmonoclonalantibodygenesand probingtheantibodyimmunoresponseagainstagivenantigen.Inthisstudis,Onthebasisof epitopeguidedselection,weexploredanewmousemAbhumanizationmethod-CDR3 directedphageantibodylibrary. 1.thevariableregionoftheheavychain(VH)andlightchain(VL)genesofan anti-humanintegrinov3(;mAbE10wereclonedbyRT-PCR.Sequencinganalysisshowed thattheV,;andVHwerederivedrfomVKIIIandI