Chapter_2_蛋白质-3-蛋白质分离技术.pptVIP

Chapter 2 蛋白质 2.1 蛋白质的概念、重要性及分类 2.2 氨基酸 2.3 蛋白质的结构 2.4 蛋白质的结构和功能的关系 2.5 蛋白质的性质 2.6 蛋白质的提取、分离和纯化 蛋白质的分离、纯化 肽的化学合成（了解） 五、六十年代，世界上，包括我国主要是从动物器脏获取肽。如：胸腺肽这种胸腺肽主要用于人体免疫。目前，这种肽已处于淘汰状态。 世界上有固相合成法、液相合成法生产的肽。用这种方法生产肽的企业在美国硅谷就有一家。他们主要是购买世界上一些精细化工厂生产的氨基酸为原料，用固相合成法、液相合成法，定向合成某种单肽。属医药原料中间体，其用途主要用于西药配方，以增强药效、增强人体对药的吸收速度和吸收率。 b.标准曲线 绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数log(M)为纵坐标，Rf值为横坐标，绘制标准曲线。 mR lgMr 兔肌动蛋白 牛血清白蛋白 兔磷酸化酶 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 c.未知蛋白分子量计算： 将未知蛋白的Rf值查到log(M)值，便可知其分子量。计算分子量。 (4) 影响因素 影响SDS-复合物形成的主要因素。SDS-电泳成败关之一，是在制备样品的过程中，蛋白质与SDS结合的程度直接影响电泳分离效果。影响结合的因素主要有三个: A.溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中以单体和SDS复合物混合存在的，能与蛋白质结合的只能是单体。单体的浓度与SDS总浓度，温度和离子强度有关。在一定温度和离子强度下，SDS处于一饱和值，即单体浓度不再随SDS中浓度增加而增加。为了使SDS与蛋白质结合充分，SDS和蛋白质结合的重量比一般是4:1或3:1。 B. 样品缓冲液离子强度 因为SDS结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时SDS单体浓度，而不是总浓度，只有在较低的离子强度溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度，所以样品缓冲液应选用低离子强度，通常是10-100mmol/l之间。 C. 二硫键是否完全打开 只有蛋白质分子中的二硫键完全被打开，蛋白质分子完全解聚，SDS充分与亚基分子结合，才能准确测定出亚基分子量。二硫键完全被打开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量。若蛋白质分子的二硫键只是部分被打开，这是测出的分子量是蛋白质分子和亚基分子的混合物。 ② 等电聚焦电泳(isoelectric focusing, IEF ） a. 原理: 通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。它是60年代初建立起来的一种蛋白质分离手段，现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最高的一种分离技术。 它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性pH梯度的凝胶中电泳，蛋白质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运动，聚焦在等电点的位置。 b.蛋白质与两性电解质 (1)蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质。在不同的pH环境中所带的正负电荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零，此时的pH为该蛋白质的等电点，在电场下不泳动。 ? (2)载体两性电解质： 在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具有以下两种功能： A 中和功能： 两性电解质的性质在分离系统中形成一个平衡稳定的pH梯度，提供中和蛋白质电荷的离子，具有pH缓冲能。 B 载电功能： 两性电解质作为电的载体，具有运载“电流”的能力，有良好的导电性能 水平板式电泳槽 垂直板式电泳槽 等电聚焦时，蛋白质混合物的分离是在具有PH梯度的介质中进行的。在电场中，每种蛋白质成分将移向并“聚焦”（停留在等于其等电点的PH梯度处，形成一个很窄的区带。它的分辨率很高，可以把人的血清分成40多个区带。适于做同工酶的鉴定。 方法: 制胶 ? 加样 ? 电泳 ?固定 ? 染色 ? 脱色? 计算 等电聚焦 ③ 双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 双向电泳是等电聚焦电泳和SDS的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 * Chapter 2 蛋白质 2.6 蛋白质的分离、纯化 研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。 因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质的基本性质进行的分析鉴定。 研究蛋白质的结构、性质和功