第二章 基因工程酶学基础.pptVIP

4、DNA连接酶作用机理 ATP（NAD+)提供激活的AMP。 ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 AMP与连接酶的赖氨酸?-氨基相连。 AMP随后从连接酶的赖氨酸?-氨基转移到DNA一条链的‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 -OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 5、影响连接反应的因素 1）反应温度 连接酶反应的最佳温度是37?C。 实用温度 粘性末端：一般采用 4-16?C。 平末端： 一般采用 10-20?C。 但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。 T4DNA连接酶的活性一般用Weiss单位来衡量，即37℃条件下20min内可使1nmol/L32P在有机焦磷酸与ATP之间产生交换的酶量为1个活性单位。 黏性末端连接酶浓度0.1单位以上即可，而平末端连接可能需要1-2个活性单位。 反应时间，在16 ℃时，4h即可，而在4 ℃时则需连接过夜。 2）连接酶浓度 3）ATP浓度 一般，浓度范围在10 μmol-1 mmol/L，ATP最适的终浓度为0.5 mmol/L。 ATP浓度高至5 mmol/L，影响平头末端的连接。 ATP浓度高至7.5 mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。 相同的分子末端间存在竞争，形成不同构型的DNA分子（自身环化、线形多聚体、环化多聚体以及重组质粒）。 分子越