READH与FDH的融合蛋白体系的构建研究.pdfVIP

READH 与FDH 的融合蛋白体系的构建 1 吴希，邢新会，张翀 （清华大学化工系，北京，100084） 摘要： 构建并比较了源于红平红球菌的手性醇脱氢酶（READH ）与甲酸脱氢酶（FDH ）的融合蛋白体系， 为新型辅酶再生系统的开发提供基础性数据。结果表明： READH 与 MBP 、FDH 融合后较大地影响了 READH 的活性。在三种融合策略中，READH 在N 端融合FDH 后活性最高，FDH 的N 端融合READH 后 的活性最高，相反FDH 在C 端融合READH 后不具有活性。 关键词：融合蛋白；辅酶再生；手性醇脱氢酶；甲酸脱氢酶 The construction of fusion protein systems composed of READH and FDH Wu Xi,Xing Xinhui,Zhang Chong (Department of chemistry Engineering,Tsinghua University,Beijing 100084,China ) Abstract: The fusion protein systems composed of READH and FDH were constructed and compared to provide basic data for the development of new cofactor regeneration systems. The activity of READH was depressed after fusing to MBP or FDH. Among three fusion proteins, READH of which the N terminus was fused to FDH got the highest activity. As to FDH, when its N terminus was fused to READH, it got the highest activity, but it had no acitivity when its C terminus was fused to READH. Keywords: fusion protein ；cofactor regeneration ；READH ；FDH 引 言 手性芳基醇是一种重要的手性化合物，在液晶、药物、香料和农用化学品的生产中具 有重要的应用[1] 。利用氧化还原酶生产手性芳基醇，除了需要合适的酶外，还需要提供高效、 [2] 低成本的辅酶再生系统 。 本文采用的READH 是来源于红平红球菌的依赖于NADH 的S 型醇脱氢酶，可以催化 苯乙酮生成(S)-1-苯乙醇，FDH 是依赖于NAD+ 的甲酸脱氢酶，可以用于还原型辅酶NADH 的再生。本文构建并比较了不同的READH 与FDH 的融合蛋白体系，旨在强化辅酶在分子 内的高效传递，为新型辅酶再生系统的开发提供基础数据。 1 实验材料和方法 1.1 质粒和菌株 E.coli TB1 为宿主菌，pMAL-c2X 本实验室保存。pMD-readh ，pFDH1 本实验室构建。 1.2 重组质粒pMAL-c2X-readh 与pMAL-c2X-fdh 的构建 PCR 扩增readh 及fdh 基因，对PCR 的扩增产物及质粒pMAL-c2X 进行双酶切，连接。 联系人：邢新会，E-mail ：xhxing@tsinghua.edu.cn 第一作者：吴希（1988-），女，博士研究生 构建得到的质粒分别命名为pMAL-c2X-readh ，pMAL-c2X-fdh ，分别用于表达MBP-READH ， MBP-FDH 融合蛋白。 1.3 重组质粒pMAL-c2X-readh-fdh 及pMAL-c2X-fdh-readh 的构建 PCR 扩增readh 及fdh 基因，对PCR 的扩增产物及上节构建的两个质粒进行双酶切