定位于人类17号染色体上新发现的非编码RNAncRNA基因的鉴定及其在神经母细胞瘤中作用研究.pdf

·中文论著摘要· 定位于人类1 基因的鉴定及其在神经母细胞瘤中作用研究 刖 昌 神经母细胞瘤的发病多是由于基因缺陷引起，包括MFCN基因的扩增，l号 染色体短臂的缺失，11号染色体长臂的缺失和17号染色体长臂的增添(gmn)。 其中，以17号染色体长臂的增添在高风险神经母细胞瘤中最为常见，然而有关候 选基因的作用机理至今仍不清楚。 在本研究中，我们利用细菌人工染色体(BAC)基因芯片对236例神经母细 Genomic Hybridization， 胞瘤样本进行了比较基因组杂交(array-Comparative 本进行基因表达谱分析。综合上述数据，结果发现位于人17号染色体2区5段1 带(17q25．1)存在一个新基因。该基因从未被报道过，通过鉴定发现该基因有2 个剪切体，即Nblal0727和Nblal2061。NorthernBlot结果提示该基因mRNA转 录长度大约为2．3kb，生物信息学分析结果显示该基因不含有长的开放阅读框架 (OpellReading 因不能产生任何的蛋白质产物。这些结果提示了该基因为非编码RNA，由于临床 数据显示该基因在恶性度高、预后差的神经母细胞瘤里异常高表达，因此取名为 RNA in ncRAN(：non-codingexpressedAggressiveNeuroblastoma)。 对70例散发神经母细胞瘤病例进行基因表达谱分析显示，该基因的mRNA 高表达与患者的不良预后存在明显的相关性(pO．001)。多因素分析结果显示 基因的扩增，而存在的独立预后因素。软琼脂克隆形成实验证明外源性表达ncRAN 经母细胞瘤细胞系SH．SY5Y生长明显受到抑制。由此鉴定，ncRAN基因是定位于 人17号染色体上的长的非编码RNA，并在神经母细胞瘤中具有癌基因的特性。 实验方法 一、 临床资料 收集的神经母细胞肿瘤样本来自日本多个医疗机构，经手术或是送检而得。 236例神经母细胞瘤样本用于比较基因组杂交技术分析，136例样本用于基因表达 谱的分析，其中各有112例和70例散发病例。临床标本根据国际神经母细胞瘤分 本病例中相对应的MYCN扩增情况已在发表文章中报道。 二、 方法 1、比较基因组杂交技术(array．CGH)和表达谱基因芯片技术 利用包涵整个人类基因组的2464个细菌人工染色体(BAC)克隆的生物芯片， 对236例神经母细胞瘤进行比较基因组杂交技术分析，分辨率小于1．2Mb。从临 获得5340个eDNA，对136例神经母细胞瘤进行基因表达谱分析，该芯片仅限于 日本千叶癌中心研究局的相关神经母细胞瘤研究。比较基因组杂交(array-CGH) 和表达谱基因芯片的相关数据可以登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)高通 分别为GSE5784和GSE5779。 2、细胞培养和转染 COS7和NIH3T3细胞的瞬时转染。 3、质粒构建 2 全长，并将其插入到真核表达载体pcDNA3或是pcDNA3．FLAG质粒中。 4、体外转录和翻译 T7Quick 禾0用TNT coupledtranscription／translation 根据产品说明用[35s]-标记甲硫氨酸对蛋白产物进行标记。之后，对相应的蛋白产 物进行SDS—PAGE凝胶电泳和放射自显影检测。 5、【35S】．蛋白标记 时后，lxPBS润洗细胞三次后，加入不含甲硫氨酸和抗生素的新鲜培养基。2小 时后，加入浓度为O．1mCi／ml[35S]．标记甲硫氨酸的培养基，继续培养。收集细胞 后，全细胞裂解液用于免疫共沉淀，进行SDS．PAGE凝胶电泳和放射自显影检测。 6、RNA分离及半定量PCR 利用AGPC法将totalRNA从冷冻组织中分离出来。按照试剂盒说明，利用逆 RNA用于 转录系统，在系统中加入随机引物和Su