家蚕BmNPV表达载体系统高效表达人乙肝表面抗原（PreS2S）及表达产物免疫原性的研究.pdf

家蚕／BmNPV表达载体系统高效表达人乙肝表面抗原 (PreS2+S)及表达产物免疫原性的研究 摘 要 (一) 家蚕／BmNPV表达载体系统(家蚕生物反应器)作为外源蛋白的低成本高效生 产体系日益受到国内外的关注，数百种有用蛋白已在家蚕中获得成功的表达。外 源蛋白基因在家蚕中的表达水平相对其他表达系统己很高，但仍远远低于野生型 病毒的多角体蛋白在家蚕中的表达量。为了进一步提高外源蛋白在家蚕／BmNPv表 角体基因序列对外源蛋白在家蚕中表达的作用及其作用机制，并对该基因高效表 达的环境条件进行了优化。 DNA共转染 家蚕培养细胞，二者在胞内发生同源重组，通过空斑筛选、DNA点杂交等手 段鉴定出含有HBMp基因的重组病毒BmPAK-HBMp。 基因，为本实验构建]感染家蚕细胞及蛹，对两种病毒的表达产物用ELISA进行了跟 3．98 u ll 106细胞及46．6 g／2x rBsAg表达量分别为2．58iig／2X106细胞及26．3ll g／ml蛹血淋巴；前者与后者相 EE，HBsAg表达量分别提高了60％a和80％。B 抗原性在细胞中约提高了8倍，蛹中约提高了lO倍。 ATG开始表达中蛋白全基因(PreS2+S)。 kD、 有4种不同分子量的蛋白质和鼠抗人的一抗发生免疫反应，大小约分别为3l 30kD、28kD、25 kD。推测31 达产物，同时具有PreS2和s抗原性，30 kD处的杂交条带为起始于s基因起始 密码子ATG表达产物的糖基化形式，25 kD的条带可能是中蛋白的降解产物，而 28kD的条带可能25l【D条带的糖基化形式。 化结果表明，外源基因表达的宿主蚕品种对表达量的影响很大，rHBsAg在浙蕾× 春晓、丰一X54A及白玉×新杭中的表达量最高，在871X872中的表达量最低， 不同品种间之间的表达水平可相差8倍，可见选择适当的表达宿主(蚕品种)可 以大幅度提高外源基因的表达产量。蛹接种后保育的温度对蛹的表达活性也有较 的表达量下降1倍。 接种病毒的滴度及不同饲养季节对表达活性有一定的影响。较高的接种病毒 活性的影响。实验表明，4℃下贮存半个月对rHBsag的表达活性没有太大的影 响；但冷藏时间超过半个月rHBsAg表达量明显降低。 (二) 能获得高水平表达，并且其表达产物能聚集成22nm的颗粒。但家蚕表达的乙肝表 面抗原蛋白的免疫原性至今在国内外尚未见报道。 Ⅱ 诱导的免疫应答反应至少能持续6个月以上。 的sD大鼠，将重组病毒感染后的家蚕蛹，制成口服剂型灌胃大鼠。结果发现，在灌 周。对照鼠体中没有产生抗体。抗体下降后的第4周，对口服免疫后抗体转阳的sD u 鼠皮下注射(1g7只)商业化酵母疫苗(S抗原)，同时对灌胃正常蛹的鼠注射同 样剂量的酵母疫苗做对照。注射后第3周，鼠体内开始出现应答反应，第5周达应答 至少持续7周以上；灌胃正常蛹的sD鼠经皮下免疫后，未检测到对抗原的免疫反 u 苗单剂腹腔注射过的SD鼠(1 应答反应能持续4周以上。 口服疫苗同时具有刺激局部粘膜免疫系统产生分泌I酗和诱导系统性免疫反应 的能力，而且可以简化接种程序，便于疫苗的接种，减少乙肝病毒的感染。因此口 服疫苗要比传统的注射疫苗更为优越。家蚕／BmNPV表达载体系统具有安全性好、产 量高、生产成本低及表达产物的后加工能力强等独特的优点。我们的研究表明，． 性．并具有～定的口服免疫原性。因此随着对家蚕生