Realtime_PCR的原理和应用-release.pptVIP

* The world leader in serving science Realtime PCR的原理和应用 Yang Sun, PhD Product Specialist 主要内容 Realtime PCR的原理 Realtime PCR的应用 Realtime PCR的问题及解决方法 Real Time PCR的概念 Real time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 Ct值 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 Real time PCR的原理 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0(1+Ex)Ct(2) 整理方程式(2)得: log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3) 最后结论： Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 Real time PCR的原理 Real Time PCR的方法 染料法 使用内掺式染料 SYBR Green I 探针法 使用序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 分子信标的优点 对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一 荧光背景低 分子信标的缺点 设计困难 无终点分析功能 只能用于一个特定的目标 价格较高 Real Time PCR的方法 Real time PCR数据处理方法 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数， ??标准曲线法 Log起始拷贝量与Ct呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M 将正对照模板按照10倍进行稀释并且进行PCR，将所得的Ct值进行作图， 所得的斜率为S，则： 影响效率的因素为：引物、镁离子以及探针的浓度 PCR效率的计算方法 Real time PCR数据处理方法 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： ?含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ?含有和待测样品相同扩增片段的cDNA ?PCR的产物 含有已知数目的与待测样品相同的扩增片段的细胞 Cited from Clinical Chemistry 48:81178–1185 (2002) Real time PCR数据处理方法 Real time PCR数据处理方法 ~2 delta-delta Ct 主要内容 Realtime PCR的原理 Realtime PCR的应用 Realtime PCR的问题及解决方法 Realtime PCR的应用 定量起始模板浓度 基因型分析 产物鉴定 SNP分析 病原菌检测 药厂GMP认证 突变测定 物种鉴定 主要内容 Realtime PCR的原理 Realtime PCR的应用 Realtime PCR的问题及解决方法 Real time PCR的问题及解决方案 该选择绝对定量还是相对定量？ 绝对定量的问题： 费时费力，而且也有相当多的问题，目前广泛使用的在260nm波长下定量的方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。 标准品的稳定保存很难获得成功，高浓度的核酸物质易于被降解，而每次配制新的标准品又会增加批间差异。 每次测定样本都要同时测定标准品，而热循环仪的样本孔往往有限，所以使得不能在单批内测定更多的样本，这样也就使实时PCR的高通量有所降低。 由于样本来源存在极大的差异，所以很难保证标准品与目的基因的扩增效率一致。这样会大大增加结果的变异，即使是各样本的DNA（或cDNA）有极小的差异或模板片断不均一，都会对定量的结果造成很大的差异。 若选择绝对定量则应该注意： 选择与样品具有完全相同序列的标准品 每次进行实验时尽量使用新鲜配制的标准品 尽量选用完全相同的体系 若选择相对定量则应该注意： 选择合适的看家基因，通常可供选择的看家基因包括GAPDH 、β-ac