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RNA的提取及其定量分析 张 许 2014-10-22 主要内容 一、RNA的提取 二、逆转录体系 1、实验原理 2、注意事项 3、实验流程 三、荧光定量PCR 1.荧光定量PCR概念 2.荧光定量PCR原理 3.荧光定量PCR分类 4.荧光定量PCR实验方法 一、RNA的提取 氯化锂沉淀法 ：SDS 是一种去污剂，可以抑制内源RNA 酶的活性，它不但可解聚核酸与蛋白质的结合，还可与蛋白质带正电荷的侧链结合，形成SDS－蛋白质复合物而沉淀。4 M LiCl可选择性沉淀RNA。 Trizol法 ：Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍（强变性剂）配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA 的完整性。 mRNA提取试剂盒: 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。 §1.实验原理 1、内含二硫键，变性后会迅速重新折叠。 2、不需二价阳离子激活。 一、RNA的提取 Structure of RNase A §2.注意事项 一、RNA的提取 RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。实验台面 等要彻底清理。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C.实验所涉及的离心管，枪头必须为RNA专用；处理RNA的移液器专用。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。 RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。 §2.注意事项 一、RNA的提取 §3.1匀浆化作用 组织 100mg，加 1mlTRIzol 匀浆（要彻底，后转至EP 管） 组织匀浆量100mg 时分装1ml/每EP 管 将匀浆样品在15—30°C 条件下 孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。 在加入氯仿之前（第1步）， 样品能于-60- -70℃保存至少一个月。 每5—10×106的动物细胞，植物或酵母菌 细胞或每1×107 细菌加1ml的TRIZOL ， 反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态。 一、RNA的提取 §3 .3 RNA的沉淀 加等体积异丙醇（约400 -500μl），混匀室温10 分钟 转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP 管中 4℃，离心12000g，10分钟，弃上清 RNA沉淀在离心前通常不可见， 形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 一、RNA的提取 §3.4 RNA的洗脱 加冰预冷的75%乙醇（用DEPC 水配）， 轻弹混合样品。 4℃离心7500g，5 分钟 弃上清，空气中干燥5-10 分钟（不能完全干燥） RNA沉淀在75%乙醇中 于2-8℃能保存至少一周， 于-5- -20℃能保存至少一年 一、RNA的提取 §3.5 RNA的再溶解 溶于 DEPC 水中至20μl（10μl-20μl） （可在55-60℃水中，10 分钟助溶） DEPC水中溶解的RNA于-70℃， 或置于冰上马上进行逆转录和PCR DEPC水:是用1‰DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水。经检测不含　RNase、DNase和proteinase。 RNA的质量检验 未降解的RNA在琼脂糖凝胶电泳后应该能看到三条带：28S rRNA；18S rRNA；由tRNA、5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊迁移较快的带，且28S的亮度应为18S两倍，且都没有弥散现象。如果孔附近还有明带，则表明产物中有DNA存在。 二、RNA定量技术 优点 不足 Northern