甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA 干扰载体的构建研究.pdfVIP

江苏农业学报(Jiangsu ofAgr．Sci．)，2013，29(1)：20～27 http：／／www．J$flyxb．COm 付三雄 ，张 超，陈 松 ，等．甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建[J]．江苏农业学报 ，2013，29(1)：20-27 doi：10．3969／j．issn．1000~ O．2013．01．004 甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体 的构建 付三雄 ， 张 超， 陈 松 ， 周晓婴， 戚存扣 (国家油菜改良中心南京分中心，农业部长江下游棉花与油菜重点实验室(南京)，江苏省农业科学院经济作物研究所 ，江苏 南京 210014) 摘要： 采用基因芯片技术，从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶 (Pyruvatekinase，PK) 基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰 (RNAi)载体，通过设计引物克隆了PK基因长498bp的siRNA靶 序列，连接到pEASY—T1载体上，采用NotI和XhoI酶切，酶切产物连接到RNAi平台载体pHurricane的NotI和 XhoI位点，通过多重PCR鉴定证实载体构建成功，然后将上述 基因反向重复框克隆到加入 napin启动子的 pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上，构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶 切证实载体构建成功，为进一步研究尸 基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。 关键词： 甘蓝型油菜 ；丙酮酸激酶 ；RNA干扰 ；载体构建 中图分类号： $565．4 文献标识码 ： A 文章编号： 1000-4440(2013)01-0020-08 Construction ofaRNA interferencevectorofBrassicanapUSL．pyruvate kinasegene FUSan-xiong， ZHANGChao， CHENSong， ZHOUXiao-ying， QICun-kou (^ ngSub—CenterofNationalCenterofRapeseedCropImprovement~KeyLaboratoryofCottonandRapeseed( ng)，MinistryofAgriculture~Institute ofIndustrialc ，flan~uAcademyofAgriculturalSciences，Na ng210014，China) Abstract： Apredominantlyexpressedgene，pyruvatekinease(PK)gene，controlling0i1accumulation，hadbeeni— dentifiedinthepreviousstudy．ToconstructaPK RNAivector，a498一bptargetPKgenesequencewasamplifiedandtrans- ferredintothepEASY T·1vector．Subsequently，thetargetDNA fragmentswerecutoffbyenzymesNotIandXhoIanddi— rectionallyinsertedintoplantRNAiplatform vectorpHurricane，anewlydevelopedRNAivectorinourlab，toform thePK inverserepeats．ThePK inverserepeatsrfagmentwasthenclonedintoamodifiedvectorpCAMBIA1390underthedrivenof arapeseedseed—specificpromoternapin．RestrictionenzymedigestionverifiedthesuccessfulconsturctionofRNA interfer— encevector．ThePKRNAiconsturctionwilllayafoundationofrstudyinthe