rhIFN-γ(pET41b)发酵方案(改稿).docVIP

重组人干扰素-γ （Recombinant　Human　Interferon γγ） 发酵方案 （EA060090101-ii001） 综述 1965年Wheelock等首先在PHA刺激的白细胞培养上清中发现具有IFN样抗病毒物质，但在pH2条件下即失去抗病毒的活性。1973年Youn-gert和Salvin发现来自淋巴细胞培养上清中存在一种IFN，但抗原性不同于以往发现的IFN，遂命名为II型IFN, 1980年统一命名为IFN-γ。1981年Goeddle等将IFN- Y基因克隆成功 [1]。IFN-γ在抗病毒、调节免疫及抗纤维化等方面作用的独特性及与Ⅰ型干扰素的协同作用而逐渐得到人们的认识。 　 1.1 IFN-γ的产生 主要由活化T细胞产生，在小鼠，由Thl亚群产生。当抗原、PHA或Con-A刺激后T细胞分泌IFN-γ，通常与IL-2的产生相一致。目前认为巨噬细胞活化因子(MAF)的主要活性存在于IFN-γ中。此外，活化NK细胞也可产生IFN-γ。 1.2 IFN- Y的分子结构 IFN-γ是一类分泌型糖蛋白，由143个氨基酸组成，(不含起始密码ATG表达的蛋氨酸)，其相对分子量为16924。而重组干扰素-γ相对分子量在14000-16000之间，小于标准相对分子量，这是因为重组干扰素-γ在C末端有氨基酸丢失现象[2]。一般为13-18个氨基酸片段。易发生分子断裂的位点常位于C端125, 128, 130等。原因可能与表达系统内的蛋白酶作用有关。(此种酶的专一性可能是在Lys-x肽链上。) IFN-γ的N端，在表达产物中完整，没有缺失出现，并且前14个氨基序列重组型与天然IFN基本一致。天然pIFN-γ是由两个21～24ku亚基组成的同源二聚体。亚基间大小差异主要由糖基化程度不同造成的。 1.3 IFN-γ的编码基因和受体 与I型干扰素(IFN-α,β,ω)相比，它仅有一个编码基因。IFN-γ基因中含有4个外显子和3个内含子，定位于人的第12对染色体长臂和小鼠第10对染色体上 [3]。分析人IFN-γ(hIFN-γ)和小鼠IFN-γ(mIFN-γ)的序列，分别发现了两个与SV40T(simian virus 40 large T antigen)的核定位信号相似的碱性氨基酸序列，可能在核内定位和信号转导上发挥重要作用，这些位点突变或丢失可导致IFN-γ丧失生物学活性[4]。近年来研究发现，C末端的变异影响着hIFN-γ的抗病毒和抗增殖活性。去除C末端最后3个、6个或9个氨基酸，可逐渐增加IFN-γ的活性；但是缺失9个以上氨基酸，则表现出截然不同的效应，但是缺失9个活性hIFN-γ可降低至原来的1/10[5]。 IFN-γ功能的有效发挥有赖于细胞膜上受体的完整性。研究表明IFN-γ受体(IFN-γR )由α和β两种亚基组成。现在普遍认为IFN-γ通过与位于几乎所有细胞表面的IFN-γ的受体相互作用来实现其生物功能的。具有功能活性的IFN-γ受体由两个亚基构成：90KD的α链(IFNGR1)和62KD的β链(IFNGR2)。IFN-γ的α，β亚基分别定位于人第6和21对染色体上，以及小鼠第10和16对染色体上。亚基即配体结合亚基，是二价的高亲和力受体与同型二聚体的IFN-γ。结合形成稳定的1: 2中间复合体，其胞外区与IFN-γ的N末端结合，而胞液区与C末端结合。随后，这一中间复合体作为结合模板，结合2分子β亚基，生成有活性的1:2:2信号复合体，从而介导信号向细胞内传递。许多研究表明，胞内的IFN-γ的应答是因为IFN-γ受体活化物和JAK-STAT信号途径的相耦合的配替诱导途径。IFN-γ信号途径需要三种特异性的JAK-STAT成分，酪氨酸激酶蛋白1，酪氨酸激酶蛋白2和转录因子Stat1[6]。 合成干扰素-γ的细胞主要有CD4T淋巴细胞，免疫记忆细胞CD45PA，杀伤T细胞，NK细胞，树状细胞，B淋巴细胞。事实上，许多抗原都可以刺激细胞以一种或多种方式分泌干扰素-γ。例如，B淋巴细胞就需要一种称为IL-1中间因子，而NK细胞需要IL-2诱导干扰素-γ的生成。人干扰素-γ是一种糖基化的蛋白质，具有2种构型。 1.4 γ-干扰素作用机理 IFN-γ作用于不同的细胞可启动一条或多条不同的信号转导途径，不同的信号途径又可转录出不同的IFN-γ刺激基因。这些干扰素刺激基因的相互协同作用才得以实现干扰素生物学功能的多样性[7]。 与宿主防御功能相关的IFN-γ刺激基因中，IGTP是较早发现的IFN-γ诱导的GTP酶。随后又陆续发现TGTP、LRG-47、IRG-47、IIGP和GTPI等基因结构具有相似性，因而归为IFN-γ诱导 GTP酶家族。它们均能编码47-48 kD的蛋白质，其中包含有GTP结合序列。研究发现，IGTP、I