转导人bcl2基因抑制低分化鼻咽癌细胞株CNE2ANOIKIS研究.pdfVIP

转导人bcl一2基因抑制低分化鼻咽癌细胞株(CNE一2)AhOIKIS 转导人bcl一2基因抑制低分化 朱振宇赵群邓诣群马涧泉 (中山医科大学生物化学教研室广州510089) 摘要：研究人bcl一2基因高表速能否抑制人低分化鼻咽癌细胞株(CNE一2)发生．jmo／kis效 染法导八CNE一2细胞株中。用流式细胞仪根括免疫荧光定量法筛选高表达bel—2单细胞克隆 株。用振摇覆polyheme覆盖培养皿等方法防止细胞粘附。建立Anoikis模型；抽提细胞DNA观察其 是否发生片段化；用双染色法(gO—PRO一1／H)幢测细胞凋亡噩其比例；用WesternBlot方法检测 6 3，PARP等蛋白被激活情况。结果：成功转导人bd一2基田到CNE一2细胞株申，并筛选 其caspase 出禹敷表述的单细胞克隆椿。与时照CNE一2细胞株相比，该妇胞株有很强的抵抗由振蔫砬Poly— 胞株中的高教表选可显著押制由振摇厦Polyheme等手段所请导的．如noikis。 关t词：bel—2基因表迭细胞凋亡／ar．oikis鼻咽肿瘤 无需粘附于基底膜以及抗凋(Apoptosis)能力增强是恶性肿瘤细胞能够转移的关键性因 素…1。近年来将粘附细胞因不能粘附于细胞问质或培养瓶所导致的细胞凋亡称为Anoikis。 目前已确认bcl一2基因处于调控细胞凋亡的中心位置2，它的高表达可以抑制由很多种因素 所引起的细胞凋亡，包括抑制细胞因不粘附所诱导发生的Anoikis3J．但其具体机制尚未明确。 相关机制。 1材料与方法 1．1材料 calf (1)脂质体转染试剂盒，小牛血清(fetal 染色(Yo—PRO—l／N)法测定细胞凋亡试剂盒，购自Molecular Lifesciences公司产品。 醋酸纤维膜、ECL试剂盒及Hyperfilm底片为Amersham J．Korsmeyer博士惠赠。 学院Stanley 1．2实验方法 1．2．1 -23l· 第二届广东青年科学家论坛论文集 (详见试剂盒说明书)，筛选采用含G418l rr∥面的1640培养基培养一周后，改用0．7m∥nd C418维待二周。存活的阳性细胞克隆细胞(cNE一2B)经扩大培养，两次精确细胞计数后，稀 释成5细胞／ml，按0．2m∥孔加至96孔培养板的小孔中继续培养2周左右。仔细观察各孔形 成单细胞克隆情况，标记仅有1个克隆形成的小iL，将其转移至24孔培养板中继续培养，再转 移至T一25培养瓶中培养备用。 1．2．2流式细胞仪荧光密度分析-45 联的鼠抗人bel一2单克隆抗体Io山，在室温、蔽光条件下保温30rnin，laBS洗2次后，加人IrnI穿透 性缓冲液，震荡混均后，荧光密度检测筛选出高表达bel一2的CNE一2单克隆细胞株(CNE一 2Bb)。双染色法(vo—PRO～1／PI)可检测细胞是否发生凋亡、坏死及其比率。 1．2．3防止细胞粘附的方法【6] 的滤膜后按0．95∥mm2铺盖6孔培养板，在超净工作台中风干后，用PBS洗3次，分别按1x 情况。 (2)振摇：60次／rain，3600旋转振摇，防止细胞牯附，18h后检测。 1．2．4用常规抽提阱JA片段的方法|70即离·tL,收集细胞，加入裂解液在56。C保温4h， 270009离心30rain，去上清后经真空干燥，在加适量TE溶解，取15一经琼脂糖凝胶电泳，紫外 灯下观察结果并拍摄。 1．2．5Western Blot：8-：常规方法，按试剂