积雪草苷对真皮成纤维细胞胶原合成的诱导作用研究.pdfVIP

积雪草苷对真皮成纤维细胞胶原合成的诱导作用 吕 洛1，应康2，魏少敏1，林惠芬1，马来记1，毛裕民2 (1．上毒家化联合股份有碾公司科研部，上毒200082；2．复旦大学生命科学院遗传所遗传T程国家重点实验室。上毒200433} 摘要：应用积雪草苷(Asialieoside，Ad)作用于体外培养成纤维细胞(H咖SkinFibroblast，HsFb)后，应 用基因芯片杂交技术，研究Ad对HSFb基因表达谱的影响；进一步，通过Northern杂交和放射免疫技术研 究Ad对胶原代谢相关可疑靶基因在mRNA水平和蛋白水平的影响，以探讨Ad在皮肤损伤修复中的作用机 制。结果显示：与空白对照组相比，Ad对细胞外基质合成相关基因在不同时相现象具有明显的调节作用； 进一步实验结果证实，在蛋白水平和mRNA水平，Ad具有刺激HSFbI型和Ⅲ型胶原合成的作用。 关键词：积雪草苷；成纤维细胞；放射免疫技术；基因；基因芯片技术 1．2主要实验方法 积雪草[Centellaasiatica(L．)Urban]为伞形科 积雪草属植物，在许多国家和地区的传统医药领域里 1．2．1 HSFb培养 中的应用已有几千年历史。我国中医中药对积雪草的 取手术后剩余的正常皮肤，采用胶原酶消化培养 内服和外用也已有两千多年的历史，主要用于湿热黄 疸、痈肿疮毒、跌打损伤等病症…1。许多研究证实， 下，按细胞数的1：3比例进行传代培养。本实验所用 积雪草提取物可通过有效地促进皮肤损伤局部胶原合 为第4—6代细胞。应用含10％小牛血清的DMEM完 成代谢，并在皮肤损伤后的组织修复方面有重要的作 全培养基在37℃，5％c02条件下培养。 1．2．2 用【2,3J。积雪草苷(Asiaticoside，Ad)为积雪草提取mRNA的抽提、纯化及标记 物三萜皂苷的主要成分之一，已有的资料显示，在各 种皮肤损伤修复治疗中，无论是在正常创面，还是在 Midi HSFb的RNA，用OliGotex的mRNAKit纯化mRNA， 延迟愈合的创面中，Ad均具有促进皮肤损伤修复的 参照Schenade方法反转录标记cDNA探针并纯化。 药物活性。研究证实，Ad通过其促进成纤维细胞增 1．2．3基因芯片的杂交、检测与结果分析 殖、抗菌和抗氧化活性而能够有效增加愈合组织中的 具体操作见参考文献[7I。 羟脯氨酸含量、抗张力强度、胶原含量，并有更好的 1．2．4 上皮化速率和愈合后外观HJ。本实验在完成Ad对 根据PINP和PIIINP的RIAKit提供的说明书进行 HSFb生物学作用影响和药代动力学影响研究的基础操作，最终数据经7计数仪随机附带软件处理，获得 上，应用细胞生物学技术和基因芯片杂交技术，通过 测定值，结果以又±s表示。 1．2．5Northern 研究Ad对Hsn基因表达谱变化，以及胶原代谢部 blot杂交 分相关可疑靶基因在mRNA水平和蛋白水平的影响， 杂交操作步骤及结果分析参照文献旧J。 探讨Ad在皮肤损伤修复中的作用机制。 1．2．6统计学分析 l材料与方法 所有的数据使用Excel软件进行统计学处理。 1．1主要实验材料 2结果 Ad(纯度92％)购于上海医药工业研究院；I 2．1基因芯片表达谱分析结果 I of 在三次不同杂交过程的基因芯片表达谱结果(图 型和Ⅲ型胶原的前胶原氨基端肽原(ProcⅪUage