可控裂解的产过氧化氢酶基因工程菌的构建研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次奎国发酵工程学术计论套论文集 可控裂解的产过氧化氢酶基因工程菌的构建 段绪果，沈微，诸葛健 (扛南大学工韭生物技术教育部重点实验室，工业微生物研究中心．江苏无锡214036) 摘要：通过PCR方法定点诱变并扩增得到温度敏感的T4噬酋体溶菌啐基因矿，与表达 coli coli 载体pUCl9连接后转化EJMl09，得到重组菌株E JMl09(pUCl9一一)．重组菌 在三角瓶中通过徭加IPTG诱导后，悬浮于裂解缓冲液buffer TE中，菌体在10rain内暧光 度由1．75迅速下降到0．25左右，成功实现了可控裂解。将带有SD序列的T4噬菌体溶苗 coli JMl09，得到可控裂解的产过氧化氢癣基因工程苗。该重组菌在升温诱导条件下，实现 了过氧化氢酵基因和溶菌酶基因的共表迭，发酵后成功实现了细胞的可控裂解。 关键谰：T4溶菌酶，可控裂解；过氧化氢酶I温度诱导 1引言 大肠杆菌作为表达系统有许多优点o】：培养基便宜、容易培养、周期短。但是仍然存 在一些缺点；大肠杆菌为非分泌型宿主，其表达的外源蛋白大多为胞内产物，很难分泌到 胞外。目的重组蚤白在后续分离纯化前首先要破碎细胞，使内容物释放到胞外。目前使 用的破碎细胞的常用方法包括：弗氏压碎器、超声波破碎法、珠磨法、有机溶剂法、酶法以 及冻融法等o】。这些方法在细胞破碎过程中产生的热量、表面张力及机械剪切力，往往 会对一些活性蛋白的活力产生影响o]，甚至导致失活。 烈性噬菌体感染宿主细胞后．借用寄主的代谢机器合成自身的DNA和蛋白质，然后 将这些DNA和蛋白质组装成许多新的噬菌体，再通过自身裂解系统实现对宿主细胞的 裂解，而释放出来，以后这些新的子代噬菌体又去感染附近的细菌，并将它们裂解，如此 反复。而温和噬菌体在侵入宿主细胞后，其DNA可以和宿主细胞的染色体整合在一起， 并与宿主细胞同步复制，一般情况下宿主细胞并不裂解，在升温或紫外诱导下噬菌体就 会裂解细胞H]。基于噬菌体裂解机理的研究，目前已经开发出兰类利用嘴菌体裂解大肠 杆菌分离胞内产物的方法口_1“：I．利用烈性噬菌体直接感染发酵后的细胞使之快速裂 解j2．构建溶源菌，在发酵后期通过升温或紫外线诱导实现细胞的裂解；3．克隆噬菌体 裂解基因来裂解细胞。 编码基因t[n3。T4噬菌体裂解大肠杆菌是在穿孔紊和溶菌酶协调作用下完成的。T4 溶菌酶是胞内酶，自身不能穿过细胞质膜，而穿孔素蛋白能够改变细胞质膜的通透性，使 得溶菌酶可以穿过细胞质膜进入周质空间，进而作用于细胞壁。本实验拟采用将T4噬 菌体裂解基因串联到含有过氧化氢酶的温控表达载体上，利用升温诱导的方法实现两种 第四次全国发酵工程学术讨论会 基因的表达，发酵后将菌体悬浮于禽有EDTA的缓冲液中，利用EDTA来模拟穿孔素的 作用，实现细胞的可控裂解。 2材料与方法 2．I菌种和质粒 质粒pBV--perA的为本实验室构建并保存口”；含有野生型T4噬菌体溶菌酶基因e W．Matthews 的质粒pHSl403由美国Oregon州立大学霍华德休斯医学研究所的Brian 教授赠送。pUCl9质粒购自华美生物工程科技有限公司。 2．2培养基和培养条件 LB培养基(g／L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH7．0。添加1．5％琼脂为LB 固体培养基。使用前加入氨苄青霉素至100 pg／mL。 发酵培养基(g／L)：无水葡萄糖10，(NH．)2SO‘8，NaCI3，KHzPq4，您HPO．15， 7．0。 MgSO。0．1。微量元素溶液lmL。pH 种子培养：采用新近转化和鉴定的