幽门螺杆菌Cag-PAI hp0525基因的克隆表达及其重组蛋白HP0525对SGC-7901细胞增殖的影响.pdfVIP

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2009，29(6)：30～35 幽门螺杆菌 Cag-PAIhp0525基因的克隆表达及其 重组蛋 白HP0525对 SGC-7901细胞增殖的影响木 母润红 邵世和h 钟 桥 崔蕾蕾 张成义 (1江苏大学医学技术学院 镇江 212013 2北华大学检验学院 吉林 132013) 摘要 目的：由于文献报道幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)是产生 胃溃疡和 胃癌的致病菌之一，一 个重要的影响因素是由cag致病岛编码的四型分泌系统。Hp0525是Cag致病岛中重要成分，是 一 种内膜蛋白ATPase。而幽门螺杆菌中Cag蛋白的表达 以及 CagPAI编码的各 自蛋白功能研究 得还很少，为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制和研发幽门螺杆菌诊断试剂盒及疫苗，特克隆幽 门螺杆菌NCTC11637hp0525(caga)基因，并对其进行测序 ，构建原核重组质粒，表达 HP0525蛋 白，初步研究其对SGC3901细胞增殖的影响。方法：应用PCR技术从 pylori基因组DNA中扩 增hp0525编码基因片段，克隆至pMD18-T载体后，再将其定向插入 pET-30a载体中，双酶切鉴定 筛选阳性克隆，以DNA 自动分析仪进行序列测定。测序分析正确后，经IPTG诱导表达，表达蛋 白 以Nin-NTA柱进行纯化，并经 Westernblot和 MALDI．TOF鉴定 ，透析除盐后的蛋 白，通过免疫新 西兰大 白兔和抗体效价 的测定，纯化的蛋 白作用于 SGC-79O1细胞 ，用 MTF法检测蛋 白对细胞增 殖的影响。结果：成功克隆 hp0525基 因，全长993bp，编码 330个氨基酸，与GenBank公布的其他 Hpylori菌株基因序列的核苷酸 同源性为97％一99％。工程菌诱导后 SDS．PAGE显示新生表达 蛋 白带，相对分子质量为36000，与预期一致，经Ni“一NTA柱纯化后可获得纯度为98％重组蛋 白。蛋白作用于SGC 90l细胞后 ，结果呈现一定量的时间和剂量依赖性。它是一种 ATPase，通 过测定具有一定的活性。活性为4．40IU／ml结论：成功克隆hp0525基因，并在大肠杆菌BL21中 表达，经过镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白，MTF法来检测出重组蛋 白抑制细胞增殖；同时具有 一 定的酶活力，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 关键词 幽门螺杆菌 克隆 表达 增殖 中图分类号 Q735 幽门螺杆菌(Helicobacterpriori)，简称 pylori为 从不同个体分离的 pylori显示高水平的基因多 一 革兰氏阴性，微需氧菌，可以定植于人 胃部。虽然发 样性。最惊人的变异是 ti．pylori存在或缺失一个40kb 生胃粘膜炎症反应和H．priori特异的体液免疫反应，但 的染色体 DNA，即cag致病岛(PAI)。在感染 pylori Hpriori可以长期定植在 胃粘膜中数十年或终生。大 的蒙古沙鼠动物模型中，含完整CagPAI野生型 (wT) 多数感染 pylori的个体仍无症状，但感染 pylori是 株较 CagPAI缺 失突变株更容 易引起严重 的胃炎。 发展成为胃溃疡、胃粘膜相关淋巴瘤 (MALT)以及 胃癌 CagPAI编码的一种蛋白即CagA，为转运 胃粘膜细胞的 的危险因素 “J。 一 种效应蛋白。CagA是CagPAI编码的唯一已知的效 应蛋白。当转运进入 胃粘膜细胞时，CagA可以引起广 收稿 日期：2008-08-25 修回日期：2008-12—16 江苏省科技厅项 目(BS2004021)、江苏大学高级人才资金项 目 泛的细胞改变，包括细胞蛋白质的脱磷酸化，胃粘膜细 (2004008) 胞的表型改变 (如 “蜂鸟样表型”)，Ras／MEK／细胞外信 通讯作者，电子信箱：shaoshihe2006@163．COB