2009生物技术综合实验——目的基因的获取.ppt

《生物技术综合实验》第一单元目的基因的获取 Part I 总RNA的提取和检测 二、实验原理 RNA在细胞中也是以与蛋白质结合的状态存在。 RNA的提取一般是用强变性剂使蛋白质和DNA变性，同时有效抑制核糖核酸酶（RNase）活性； 通过有机溶剂抽提去掉蛋白质、多糖等； 最后在RNA沉淀剂的作用下，分离出RNA。 RNA提取原则：① 保持核酸结构的完整性； ② 排除其它分子的污染。 二、实验原理 ＲＮＡ的提取过程中的五个关键点 　１）样品细胞或组织的有效破碎； ２）有效地使核蛋白复合体变性； ３）对内源／外源RNase的有效抑制； ４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离； 　５）对多糖含量高的样品还牵涉到多糖的有效除去。 RNA提取采用的两种主要途径 　1） 氯化锂RNA沉淀法； 　2） 直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。　 三、实验试材 实验材料：斑马鱼 试剂： TRIzol Reagent (Invitrogen) DEPC处理的超纯水（0.02-0.1％） 新开的氯仿、异丙醇及无水乙醇 其它： 超净工作台 低温高速离心机 各种规格RNase Free的枪头、EP管(1.5ml) 三、实验试材 RNase Free的烧杯 RNase Free的量筒 RNase Free的玻棒，药勺，镊子，三角瓶等。 新开的大滤纸 碎冰及泡沫冰盒 五、实验详细步骤及其说明 六、总RNA检测-纯度、浓度 1、纯度检测 A260/280（1.8-2.0为佳）如果低于该值， 表明存在蛋白质污染，重新用酚/氯仿抽提； 2、 RNA 浓度： C (ug/ml) = A260×40×稀释倍数 例如：样品RNA 总体积为 100 μl 吸取 1 μl RNA 到 49 μl ddH2O中 (50倍稀释). 测得260nm处的消光值 A260 = 0.23 样品的浓度 = 40 x A260 x稀释倍数 = 40 x 0.23 x 50 = 460 μg/ml 样品的总量 = 460 μg/ml x 0.1 ml = 46 μg 七、样品的保存 短期保存： 溶于ddH2O中，-20 ℃ or -70 ℃保存 长期保存： 沉淀于70%的乙醇中， -70 ℃保存 材料的保存： 样本一旦从生物体中分离后，细胞内的RNA就变得非常不稳定，容易降解。传统方法是用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。 目前有些厂家开发出专门的RNA保护剂，具有抑制RNase和稳定RNA的作用，将采集的组织样本等直接放入其中，即可起到稳定样本中RNA的作用。无需液氮或干冰，方便安全地在室温下保存一段时间，低温下可长期保存。 RNase何处来？ 一般来说，在RNA实验中的RNase可分为内源性的和外源性的。内源性的RNase是指细胞内固有的一些RNase。而外源性RNase则通常有两个来源： 实验中所用到试剂和设备 操作者的人为因素 所以被污染的溶液或怀疑可能污染的溶液必须丢弃！！ 如何彻底对抗RNase？I 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区；离心机、移液枪、试剂等均应专用。 操作过程中应自始至终佩戴抛弃式塑料或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入试管或污染用具。 使用无RNase的一次性移液枪头和离心管。避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。 如何彻底对抗RNase？II 玻璃、金属制品都必须在180-300℃ 烘烤～8小时。塑料制品都必须用0.5N的NaOH处理10分钟，用0.01% DEPC水彻底冲洗后灭菌，也可用DEPC水浸泡过夜，然后高压蒸汽灭菌，烘干。 无法用DEPC处理的用具可以用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。 分成小份保存溶液并在使用后丢弃。 DEPC的缺点 DEPC可以不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离纯化RNA过程中不能使用。而且它与一些缓冲液（如Tris）不能相溶。 在体外蛋白质合成系统中，暴露在DEPC中的 mRNA翻译效率降低。但DEPC处理的RNA形成DNA-RNA或RNA-