实验一_分光光度法精选.pptVIP

实验一 分光光度法 测定CuSO4浓度 生物化学和分子生物学实验 1 必须穿白大褂； 2 书包放在实验台的上层架子上； 3 实验报告在课后24小时内由实验班长统一上交； 值日生注意事项强调： 1 清洁实验台、讲台和试剂架； 2 用湿抹布擦黑板； 3 清洁比色皿； 4 将所有移液枪调到最大量程； (一)基本原理 分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。（吸收特征、吸光强度） Lambert-Beer定律，吸光度与溶液的浓度成正比，与光束通过溶液的距离(即光程)成正比，用数学表达式表示为： A=KLC C：物质的浓度(mg/ml, mol/L)，L：光程（cm），K为吸光系数或消光系数。 互补色 互补色光—— 如：黄光和蓝光； 红光和绿光。 CuSO4呈蓝色是由于溶液吸收了黄光。 溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。 当一束平行单色光通过溶液时，一部分被吸收，一部分则透过溶液。 入射光强度为I0，透射光强度为It， 则透光度T= 吸光度(A)或称光密度(OD)或称消光度(E) A= - lgT I0 It A=KLC 由于单色光透过溶液时，不仅被待测物质所吸收，而且还被比色容器与溶剂以及其它试剂吸收一部分，这部分需用空白管消除； 空白液的做法即用与样本相同的一切试剂，而不含被测定的物质。 空白管 （二）待测溶液的浓度计算 (1)利用吸光系数（消光系数）求出待测溶液的浓度： (2)利用标准曲线进行换算： (3)利用标准管法计算待测溶液的浓度： 若C为1%（g/ml），L为1cm，此时的K值称为百分吸光系数用 表示.即：C=A/ 根据Lambert-Beer氏定律：A=KLC 根据Lambert-beer定律： 标准管：As=KLCs (下标S：标准液) 待测管：Ax=KLCx (下标X：待测液) L相等，温度相同，测定同一物质，所用单色光相同，则K相同，则： As/Ax=Cs/Cx即Cx=Ax/As·Cs 在实际操作中，常使待测管体积与标准管体积相等(以X代表测定管含量，S代表标准管含量)则： X=Ax/As·S 计算待测溶液浓度时，可根据测定时实际吸取的标准液的体积(Vs)和待测样品的体积(Vx)，将上式演变为： 待测溶液浓度：Cx= 利用标准管法计算待测溶液的浓度 (三)波长的选择 (三)波长的选择 波长的选择一般是选择待测物质最大吸收峰的波长(λmax)。 根据下列三个原则： 1.应使被测溶液有适当的光密度，一般而言，适当的光密度为0.1—0.7，而以0.2—0.6最理想。过低的光密度因仪器的读数误差而产生很大的相对误差，反之，过高的光密度则往往已超过直线范围而引入误差。 2.应使干扰影响降低至最低限度。在反应中，如遇不易去除的干扰色泽，应选用对此干扰色泽最不灵敏的波长。 3.应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。 实验操作－CuSO4含量测定 试剂 标准管 测定管 空白管 CuSO4标准液(ml)120mg/ml 1.0 CuSO4测定液(ml)??? 0.8 蒸馏水(ml) 6.0 6.2 7.0 700nm比色，以空白管调零，读取As 和Ax 原始实验记录 标准管 测定管 空白管 OD 0.444 0.232 0.000 原始记录需要上课老师签字方可生效 CuSO4浓度(g/L) 实验报告 原始数据记录 右上角注：日期，室温 一、原理 二、步骤 三、结果与结论 利用直接比较法：Cx= 数据代入 待测硫酸铜溶液的浓度是： 四、讨论 7220型分光光度计的使用 1.预热5min 2.调节波长 3.放档光板，调T=0% 4.放空白管，调T=100% 5.按mode键使ABS灯亮，读取吸光度