甘草酸对LPS刺激的小肠上皮细胞炎症因子表达的影响.docVIP

精品论文 参考文献 甘草酸对LPS刺激的小肠上皮细胞炎症因子表达的影响 张娴 黄羽 曾星(广州中医药大学第二附属医院 510006) 【摘要】目的 初步研究甘草酸（Glycyrrhizic acid, GA）对LPS刺激的小肠上皮细胞IEC-6炎症因子表达的影响。方法 实验设空白对照组，LPS模型组，GA低、中、高剂量组（50，100，200 mu;g/mL）。GA各组加入相应浓度的药物作用48 h后，与模型组一起加入1mu;g/mL的LPS作用1 h，空白对照组正常培养。用杨运涛RT-PCR检测炎症因子IL-6，TNF-alpha; mRNA表达，Western blot 检测TNF-alpha;蛋白表达。结果 与空白对照组比较，模型组IL-6，TNF-alpha; mRNA表达均明显增高，与模型组比较，GA处理组的IL-6表达增高；TNF-alpha; mRNA和蛋白表达均明显下降。结论 GA能增加LPS刺激的小肠上皮细胞IL-6 mRNA的表达，同时下调TNF-alpha;的表达，GA的抗炎机制可能与此相关。 【关键词】 甘草酸 LPS 小肠上皮细胞 炎症因子 【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）16-0100-02 甘草酸是甘草的主要有效成分，在消炎、抗菌、抗变态反应有明显的作用[1]，常用于消化道疾病的抗炎抗病毒治疗中。但其确切的分子作用机制仍未充分研究[2]。本文以小肠上皮细胞IEC-6为研究对象，并用脂多糖LPS您好刺激IEC-6细胞建立炎症模型，观察甘草酸对LPS刺激的小肠上皮细胞炎症因子IL-6, TNF-alpha;表达的影响，初步探讨其抗炎作用机制。 1 材料和方法 1.1 药物与试剂 甘草酸，购于Fluka公司（批号：A0267975）；LPS购于Sigma公司（批号：A0267975）DMEM培养基、胎牛血清、0.25 %胰酶消化液购于美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购于Takara公司。RIPA缓冲液、蛋白酶抑制剂购于德国Roche公司； TNF-alpha;抗体、HRP标记羊抗鼠抗体，美国CST公司。Western blot所用试剂及分子标准，美国Bio-Rad公司。 1.2 细胞 大鼠小肠上皮细胞IEC-6，美国标准生物品收藏中心(ATCC)。 1.3 仪器 酶标仪；美国Perkin Elmer公司；FC500流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司；7500实时荧光定量基因扩增系统，美国ABI公司；电泳及转印系统，美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司。 1.4 细胞培养 IEC-6用含10 %FBS，0.1 U/mL胰岛素的DMEM，37 ℃，5 %CO2 恒温培养箱培养，0.25 %胰酶消化传代。 1.5 模型建立及实验分组 分别用1,10,50,100mu;g/mL的LPS刺激IEC-6细胞1h,6h,筛选恰当的LPS剂量和刺激时间，建立模型。实验设立空白对照组，模型组，GA低、中、高剂量组（50，100，200 mu;g/mL）。GA各组加入相应浓度的药物作用48 h后，与模型组一起加入LPS作用，空白对照组正常培养，细胞处理后进行后续实验。 1.6 逆转录定量PCR(RT-qPCR) 细胞分组处理后，收集细胞用Trizol提取总RNA，测定浓度后逆转录合成cDNA，用SYBR Green染料法荧光定量PCR检测，用内参基因GAPDH进行校正分析IL-6、TNF-alpha;mRNA表达含量。引物序列：p53IL-6前向引物为5rsquo;- TCCGCAAGAGACTTCCAGCCAGT -3rsquo;，逆向引物为5rsquo;- AGCCTCCGACTTGTGAAGTGGT -3rsquo;；Gadd45TNF-alpha;前向引物：5rsquo;- CGGTCCCAACAAGGAGGAGAAGT -3rsquo;，逆向引物：5rsquo;- TACGACGTGGGCTACGGGCT -3rsquo;；GAPDH前向引物：5rsquo;- GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGTTC -3rsquo;，逆向引物：5rsquo;- CGTCCGATACGGCCAAATCCGTT CGTCCGATACGGCCAAATCCGTT-3rsquo;。 1.7 Western b